论文部分内容阅读
研究目的:1、体外观察heme/NO2-/H2O2依赖途径和ONOO-依赖途径对脑组织的硝基化作用以及三七总皂苷（PNS）的的保护作用;2、通过海马立体定向注射ONOO-供体释放剂SIN-1,观察活体内ONOO-依赖途径诱导的海马组织中3-NT及硝基化PPARγ（nitro-PPARγ）表达情况及对PPARγ活性的影响,以及PNS的保护作用;3、观察ONOO-诱导海马组织发生蛋白质硝基化的同时是否伴有细胞损伤,以及PNS的保护作用。实验方法:1、依据3-NT形成途径,体外分别建立heme/NO2-/H2O2途径和ONOO-途径诱导的3-NT形成模型。Heme-NO2--H2O2反应体系:Hemin（50或500）μmol/L、Na NO2 5mmol/L、H2O2 1mmol/L。ONOO-反应体系:ONOO-5mmol/L。分别以牛血清白蛋白（BSA）、大鼠血浆蛋白、脑等多种组织蛋白为底物,分为空白对照组、模型组及PNS低、中、高干预组（PNS终浓度分别为50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml）,Western blotting法检测各组3-NT水平。2、大鼠随机分为对照组、SIN-1模型组、PNS低、中、高干预组,模型组大鼠经海马立体定向注射ONOO-供体SIN-1（3ml,50m M,溶于生理盐水）,对照组注射同体积生理盐水,PNS低、中、高干预组在海马注射SIN-1前30min于尾静脉分别注射125mg/kg、250mg/kg、500mg/kg PNS。（1）Western blotting法检测不同组别海马组织中3-NT、PPARγ蛋白表达,以分析ONOO-对海马组织蛋白质硝基化的诱导作用和对PPARγ蛋白水平的影响,及PNS对ONOO-上述作用的影响;（2）免疫共沉淀法检测nitro-PPARγ表达,以确定ONOO-是否诱导海马组织表达的PPARγ发生硝基化,及PNS对ONOO-上述作用的影响;（3）免疫荧光染色法观察各组海马CA1区、CA3区、齿状回的3-NT、PPARγ蛋白水平及亚细胞定位,以进一步观察ONOO-对海马组织蛋白质硝基化的诱导作用和对PPARγ蛋白表达、核移位的影响;及PNS对ONOO-上述作用的影响;（4）通过各组海马CA1、齿状回区细胞计数分析,结合Western blotting法对Bcl-2、Caspase-3（激活型）蛋白表达检测,观察ONOO-对细胞损伤的影响,及PNS的保护作用。实验结果:1、体外heme/NO2-/H2O2途径和ONOO-途径均可显著引起BSA、血浆蛋白、组织匀浆蛋白（脑、心、肌肉等）中3-NT形成,与各自对照组相比差异具有显著性（P均<0.05）。在heme/NO2-/H2O2反应体系中,心肌组织和肌肉组织比脑组织3-NT表达水平高;而在ONOO-反应体系中脑组织比心肌组织、肌肉组织3-NT表达水平高。两种途径下,与各自模型组相比,PNS低、中、高干预组BSA、血浆蛋白中3-NT表达水平均显著降低（P均<0.05）;而各组织匀浆蛋白中,PNS低浓度干预组3-NT降低不明显（P>0.05）,中、高浓度干预组3-NT水平降低显著,差异具有统计学意义（P均<0.05）。2、经海马立体定向注射ONOO-的供体释放剂SIN-1,建立脑组织蛋白质硝基化活体模型。（1）Western blot印迹法显示:1)3-NT蛋白表达:与对照组相比,不同时间点（12h、18h、24h）处死的各模型组大鼠海马组织中3-NT表达均显著增加（P<0.05）,SIN-1可引起大鼠海马组织多种不同分子量蛋白质发生硝基化;且具有时间依赖性,表现为随着SIN-1处理时程的延长而增加,差异具有统计学意义（P<0.05）。与模型组（SIN-1,24h）相比,PNS低剂量干预组3-NT表达无明显改变,而中、高干预组可不同程度地抑制海马组织中3-NT表达,差异具有统计学意义（P<0.05）。2)PPARγ蛋白表达:对照组、模型组、低、中、高干预组各组间PPARγ表达无明显差异（P>0.05）,即SIN-1、PNS处理对PPARγ蛋白表达无影响。3)Bcl-2蛋白表达:与对照组相比,模型组Bcl-2表达量明显减少（P<0.05）;与模型组相比,PNS低、中、高干预组海马组织中Bcl-2水平显著增加（P<0.05）4)Caspase-3（激活型）蛋白表达:对照组、模型组、PNS低、中、高干预组均未检测出激活的Caspase-3表达。（2）免疫沉淀检测nitro-PPARγ蛋白表达 与对照组相比,模型组SIN-1处理24h可显著诱导大鼠海马PPARγ硝基化（即nitro-PPARγ表达明显增加）,而PNS处理（500mg/kg）则降低该诱导作用,差异具有统计学意义（P<0.05）。（3）免疫荧光染色检测3-NT蛋白表达:正常对照组CA1、CA3、齿状回各区均有少量3-NT阳性信号表达,主要位于细胞浆;模型组（SIN-1,24h）各区3-NT阳性荧光信号显著增加;除胞浆外,细胞突起亦可见3-NT表达。PNS（500mg/kg）干预组显著减少3-NT阳性信号表达,细胞浆和细胞突起阳性表达均减少。PPARγ蛋白表达:正常对照组、SIN-1模型组、SIN-1+PNS（500mg/kg）干预组各组间PPARγ荧光信号强度无明显改变;对照组胞浆、胞核均有PPARγ阳性表达,即存在一定水平的PPARγ核移位;SIN-1组PPARγ荧光信号主要位于细胞浆,即PPARγ核移位受到抑制;而PNS处理（SIN-1+PNS组）使PPARγ胞浆染色降低,胞核染色增加,即降低了SIN-1对PPARγ核移位的抑制作用。实验结论:1、体外研究显示heme/NO2-/H2O2途径和ONOO-途径均可显著诱导脑组织匀浆蛋白发生硝基化;PNS（100mg/ml、200mg/ml）可不同程度地分别抑制两种途径诱导的3-NT形成,以200mg/ml作用最显著。2、体内研究显示ONOO-处理12h、18h、24h可显著诱导海马组织蛋白发生硝基化,且具有时间依耐性,以24h组作用最显著;PNS可明显抑制海马组织中3-NT表达,以500mg/kg作用最显著。3、ONOO-可体内诱导海马PPARγ硝基化,并抑制其核移位活性;PNS抑制ONOO-诱导的PPARγ硝基化,恢复其核移位活性。4、少量ONOO-（SIN-1单次注射）不会引起海马组织细胞减少和/或细胞凋亡的发生,但ONOO-引起的PPARγ失活可能会使海马组织对细胞损伤的敏感性增加,而PNS可降低这种损伤敏感性。