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伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的大多数哺乳动物的一种病毒性传染病。PRV基因组十分庞大,全长约143 kb,对其进行改造和修饰比较困难。传统的同源重组方法获得病毒突变株的效率较低、花费时间长,而利用反向遗传操作技术便于在细菌中对其基因组进行缺失、插入或突变。本研究首先提取PRV变异株(PRV-TJ)的基因组;然后通过物理剪切法获得随机断裂的基因组DNA片段;剪切片段末端,补平修饰后与pCC1FOS载体连接;用噬菌体包装蛋白包装重组DNA,感染大肠杆菌EPI300,构建了 PRV基因组Fosmid文库。筛选出基因组插入片段大小为30-45 kb的19个粘粒用于后续研究。选取10组5粘粒组合用于拯救病毒。将10种粘粒组合分别转染Vero细胞,其中有5组组合拯救病毒成功,通过观察出现细胞病变的时间,检测拯救病毒的毒价,筛选出拯救病毒的最佳组合为:FosTJ-a(1-41633 nt)、FosTJ-f(37942-69996 nt)、FosTJ-o(62988-100570 nt)、FosTJ-q(81316-117252 nt)、FosTJ-s(113582-143642 nt)。为了构建与PRV变异株VP26基因融合表达增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因的重组报告病毒。本研究应用Red/ET重组技术并以筛选的最佳粘粒组合为研究对象,首先,将两端带有50 bp大小左、右同源臂的选择标记基因rpsL-neo表达盒插入相应粘粒的VP26基因的第二个密码子之后。然后,用两端带有同样的50 bp左右同源臂的EGFP基因替换选择标记基因rpsL-neo表达盒,使用含有氯霉素和链霉素双抗性的LB平板筛选阳性克隆,获得正确改造的粘粒。最后,将改造的粘粒与未改造的粘粒共同转染Vero细胞拯救病毒,获得了融合表达EGFP基因的报告病毒rPRVTJ-VP26-EGFP,该报告病毒生长滞后于rPRV-TJ株病毒,在相同时间点重组报告病毒的滴度低于亲本病毒,此外该报告病毒的蚀斑明显小于亲本病毒。rPRVTJ-VP26-EGFP感染神经细胞胞体12 h后,能够观察到病毒粒子由胞体沿轴突传导。PRV变异株TJ株Fosmid文库的成功构建,为对PRV基因组进行快速、准确修饰奠定了基础,融合表达EGFP基因的报告病毒的构建将为PRV神经毒力的研究提供研究基础。干扰素刺激基因(ISGs)作为重要的抗病毒效应分子,其在宿主防御和清除外源病原感染方面发挥重要作用。本研究中,我们构建了 20个表达猪源ISGs分子的真核表达质粒。瞬时转染上述质粒并结合高内涵筛选系统与表达EGFP的报告病毒成功筛选到5个显著地抑制rPRV-US9-EGFP 复制的 ISGs,分别是 IFIT3、ISG15、GBP2、Mx1 和ISG20,其中IFIT3的抑制效果最显著。为了验证IFIT3是抗PRV的ISG,本研究构建了过表达IFIT3的细胞系,将其感染亲本病毒(PRV-TJ株),在不同的时间点收取细胞检测病毒滴度与基因组拷贝数,结果证实过表达IFIT3可以明显抑制PRV-TJ株复制,说明IFIT3是抗PRV的ISG。进一步研究显示,PRV感染猪或PAM细胞后,IFIT3与IFN-β转录水平明显上调。总之,本研究构建了 PRV Fosmid文库,建立了基于Fosmid文库与Red/ET重组技术的快速构建PRV突变体的方法,构建了与VP26基因融合表达EGFP基因的报告病毒,该报告病毒可以作为研究病毒粒子在神经轴突中传导的工具。此外,本研究应用高内涵筛选系统结合表达绿色荧光的报告病毒筛选到显著抑制PRV复制的ISGs分子。以上研究将为PRV变异株致病机制与疫苗的研究奠定基础,为控制PR提供新的思路和手段。