研究背景支气管肺癌是全世界范围内发病率最高的恶性肿瘤之一,支气管肺癌按照生物特性、治疗方式及预后通常分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌两类。肺腺癌是非小细胞肺癌中最常见的组织学亚型,同时也是发生于非吸烟者的最常见细胞学类型。因为肺腺癌具有发病率高、预后差、致死率高的特点,人们开始关注以细胞代谢为靶点(如天冬酰胺)的治疗策略在肺腺癌治疗中所发挥的作用。以天冬酰胺为靶点的门冬酰胺酶是目前FDA批准最有效的抗肿瘤酶制剂之一主要治疗急性淋巴系白血病和某些髓系白血病的亚型。我们的研究首次报导门冬酰胺酶对肺腺癌的细胞毒作用并能诱导细胞凋亡。细胞自噬是真核细胞内高度保守的长寿蛋白和细胞器的降解和再循环机制,对维持细胞内环境稳态、细胞增殖、分化及死亡等过程意义重大,并且与疾病治疗尤其是肿瘤治疗密切相关。现有研究发现氨基酸缺乏,例如精氨酸的剥夺可以诱导细胞发生自噬现象。但是门冬酰胺酶是否可诱导肺腺癌细胞发生自噬尚未有报道,我们首次报导了门冬酰胺酶能够诱导肺腺癌细胞A549和H1975发生细胞自噬,并且本实验还对细胞自噬在门冬酰胺酶杀伤肺腺癌细胞中的作用和相关机制进行了研究。研究目的1.本项课题探究了靶向细胞自噬和天冬酰胺的策略用于肺腺癌治疗的潜力,我们试图探讨门冬酰胺酶能否降解肺腺癌A549和H1975细胞胞外的天冬酰胺,并显著抑制肺腺癌细胞的生长,诱导肺腺癌细胞凋亡。2.天冬酰胺剥夺是否能诱导肺腺癌细胞发生以自噬流(包括自噬体的形成、自噬体和溶酶体的融合、自噬体的降解三大阶段)为表征的细胞自噬。并且抑制细胞自噬可否显著提高门冬酰胺酶对肺腺癌细胞的细胞毒作用。3.我们试图探究门冬酰胺酶对肺腺癌细胞的细胞毒作用同细胞自噬间的关系,并且评估了氧自由基在门冬酰胺酶杀伤肺腺癌细胞中的作用。本实验试图研究细胞自噬在天冬酰胺酶杀伤肺腺癌细胞中充当的角色,靶向自噬和天冬酰胺的策略能否成为肺腺癌治疗的新型方案。研究内容和实验结果1.A549和H1975细胞对门冬酰胺酶的敏感性与天冬酰胺合成酶缺陷有关。既往研究显示天冬酰胺合成酶缺陷的肿瘤细胞对天冬酰胺剥夺治疗策略敏感,因此我们使用western blot分析两株肺腺癌细胞的天冬酰胺合成酶(Asparagine synthetase,ASNS)蛋白表达情况。分别抽提A549、H1975、K562及Jurkat细胞的总蛋白,用western blot分析,结果显示,K562细胞表达天冬酰胺合成酶(ASNS)蛋白,而A549、H1975及Jurkat细胞不表达天冬酰胺合成酶(ASNS)蛋白。2.门冬酰胺酶对A549和H1975细胞的生长抑制作用。使用不同浓度的门冬酰胺酶处理A549和H1975细胞72h,采用MTT法测定各实验组的细胞活力。我们可以观察到门冬酰胺酶以浓度依赖的方式显著抑制肺腺癌细胞A549和H1975的细胞生长。3.门冬酰胺酶诱导A549和H1975细胞的凋亡。我们运用Annexin V/PI双标记染色的方法检测细胞凋亡。两株肺腺癌细胞经不同浓度的门冬酰胺酶处理后,凋亡细胞所占的比率随门冬酰胺酶浓度的增加而增多。4.门冬酰胺酶能激活A549和H1975细胞发生细胞自噬。我们采用透射电子显微镜、western blot和免疫荧光三种手段检测自噬发生。首先,我们用门冬酰胺酶(1IU/mL)分别处理A549和H1975细胞,48h后收集并固定细胞,对两株细胞进行包埋、切片及染色处理在透射电子显微镜下观察它们的超微结构。未经门冬酰胺酶处理的空白对照组的肺腺癌细胞A549和H1975镜下细胞结构完整,其细胞核及核仁清楚；而经门冬酰胺酶(1IU/mL)处理48h后的实验组细胞胞核固缩变形,在高倍镜下可见明显的双层膜结构。与空白对照组相比,门冬酰胺酶能显著诱导两株肺腺癌细胞自噬体的形成。然后,我们利用western blot技术检测自噬相关蛋白LC3的变化。用0.25、0.5及1.0IU/mL门冬酰胺酶处理两株肺腺癌细胞48h或者门冬酰胺酶(1IU/mL)处理A549和H1975细胞6h、12h及24h,分别抽提蛋白检测自噬相关蛋白LC3的变化情况。门冬酰胺酶能明显诱导两株肺腺癌细胞LC3 Ⅱ的表达量增加并且具有剂量和时间依赖性,说明门冬酰胺酶能明显诱导A549和H1975细胞发生细胞自噬。另一方面,为了进一步研究门冬酰胺酶诱导两株肺腺癌细胞发生自噬的作用,本实验还使用了荧光标记的方法观测细胞自噬流的发生。Cyto-ID(?)染料是专门用于细胞自噬检测的染料,它能特异性结合细胞内自噬蛋白并产生绿色荧光。实验组A549和H1975细胞分别用1IU/mL门冬酰胺酶处理12h、24h及48h,预处理完成后用Hoechst33342染细胞核(蓝),Cyto-ID Green Dye指示自噬体(绿),LysoTracker Red DND 99染溶酶体(红)。我们通过荧光显微镜可以发现门冬酰胺酶诱导两株肺腺癌细胞发生自噬流的三个阶段：第12h自噬体形成(绿色),第24h自噬体和溶酶体发生融合(黄色),第48h自噬体被溶酶体降解(橙色),结果显示天冬酰胺耗竭可以诱导肺腺癌细胞发生自噬流。5.自噬抑制剂氯喹与门冬酰胺酶联用增加肺腺癌细胞LC3 Ⅱ蛋白的表达。为了探究自噬在门冬酰胺酶杀伤肺腺癌细胞A549和H1975中的作用,本研究采用自噬抑制剂氯喹抑制门冬酰胺酶诱导的细胞自噬。氯喹作为自噬抑制剂,可以通过提高胞质的pH值在自噬终末阶段阻止自噬体同溶酶体的融合,导致自噬相关蛋白LC3 Ⅱ的过表达。Western blot结果显示门冬酰胺酶能引起A549和H1975细胞中LC3 Ⅱ的表达量增加,而联用氯喹能上调门冬酰胺酶诱导的LC3 Ⅱ的表达,表明氯喹能有效抑制门冬酰胺酶诱导的细胞自噬。6.自噬抑制剂氯喹增强门冬酰胺酶对肺腺癌细胞的细胞毒作用。使用自噬抑制剂氯喹与门冬酰胺酶联合或单独使用门冬酰胺酶处理A549和H1975细胞72h,采用MTT法测定各实验组的细胞活力。细胞活力以570nm波长下测定的吸光值换算成的存活细胞百分数表示。实验结果显示,与单独使用门冬酰胺酶处理组相比,自噬抑制剂氯喹与门冬酰胺酶联合使用可显著增强门冬酰胺酶对A549和H1975细胞的生长抑制作用。7.使用siRNA特异性沉默自噬相关蛋白ATG5。为深入探究抑制细胞自噬强化门冬酰胺酶杀伤肺腺癌细胞的作用,本实验采用RNA干扰技术特异性沉默细胞自噬相关基因5(ATGS)的表达,并在此基础上研究抑制细胞自噬对门冬酰胺酶抑制A549和H1975细胞生长作用的影响。我们采用siRNA-ATG5-1/siRNA-ATG5-2选择性下调ATG5,Western blot显示,同si-Contorl干扰组相比,siRNA-ATG5-1/siRNA-ATG5-2干扰组ATG蛋白的表达量明显减少,说明si-ATG5成功沉默了ATG5的表达。8.使用siRNA沉默自噬相关蛋白ATG5能显著增强门冬酰胺酶对A549和H1975细胞的细胞毒作用。在上述基础上,MTT结果显示,与si-Control干扰组的门冬酰胺酶对A549和H1975细胞的生长抑制作用相比,siRNA-ATG5-1/siRNA-ATG5-2干扰组能明显提高门冬酰胺酶对两株肺腺癌细胞的细胞毒作用。9.抑制细胞自噬可增强门冬酰胺酶诱导A549和H1975细胞发生凋亡作用。我们探讨门冬酰胺酶诱导的细胞自噬和细胞凋亡的关系,首先使用自噬抑制剂氯喹联合门冬酰胺酶预处理A549和H1975细胞24h,收集细胞流式细胞仪检测细胞凋亡。结果显示,单独使用门冬酰胺酶组细胞凋亡率分别是14.7%和18.9%,而自噬抑制剂氯喹和门冬酰胺酶共同作用组诱导AnnexinV阳性的细胞比例增加,A549和H1975细胞的凋亡率分别是32%和47%。说明自噬抑制剂氯喹抑制细胞自噬能明显增强门冬酰胺酶诱导两株肺腺癌细胞的细胞凋亡。10.自噬抑制剂氯喹和门冬酰胺酶联用能增强caspase3的活性。自噬抑制剂氯喹联合门冬酰胺酶处理A549和H1975细胞48h,或者单独使用门冬酰胺酶或氯喹处理两株细胞48h,然后使用caspase3活性检测试剂盒检测各实验组caspase3活性。同空白对照组相比,自噬抑制剂氯喹联合门冬酰胺酶组的caspase3活性显著提高。11.z-VAD-fink能显著减弱门冬酰胺酶诱导肺腺癌细胞诱导的生长抑制。使用caspase广谱抑制剂z-VAD-frnk与门冬酰胺酶及自噬抑制剂联合使用或单独处理两株肺腺癌细胞,运用MTT法检测细胞活力的变化。同单独使用门冬酰胺酶处理组或氯喹联合门冬酰胺酶处理组相比,运用z-VAD-fink抑制caspase的剪切后,门冬酰胺酶对A549和H1975细胞的生长抑制作用明显减弱。综上所述,抑制自噬能增强门冬酰胺酶诱导的A549和H1975细胞的caspase3依赖的凋亡。12.N-乙酰半胱氨酸(N-acety-cysteine,NAC)抑制门冬酰胺酶诱导肺腺癌发生细胞自噬和线粒体产生氧自由基。为了探究氧自由基在门冬酰胺酶诱导肺腺癌细胞发生细胞自噬和细胞毒作用中所扮演的角色,我们使用抗氧化剂NAC和门冬酰胺酶联合处理A549和H1975细胞48h,然后分别使用Mitosox、Cyto-ID标记线粒体氧自由基和自噬体。门冬酰胺酶处理组中红色荧光提示线粒体氧自由基的产生,绿色荧光提示自噬体形成,而抗氧化剂NAC和门冬酰胺酶联合处理组中红色荧光和绿色荧光强度明显减弱,提示抑制氧自由基能减弱门冬酰胺酶诱导A549和H1975细胞发生细胞自噬的作用。13.清除氧自由基削弱门冬酰胺酶对肺腺癌细胞的细胞毒作用。我们利用抗氧化剂NAC和门冬酰胺酶处理A549和H1975细胞,或者门冬酰胺酶单独处理两株肺腺癌细胞,48h后用MTT法检测细胞活力。同门冬酰胺酶单独处理组相比,抗氧化剂NAC和门冬酰胺酶联合处理组的肺腺癌细胞的活力显著提升。此项结果表明氧自由基介导了门冬酰胺酶对A549和H1975细胞的细胞毒作用。14.抑制自噬能增强门冬酰胺酶诱导肺腺癌细胞产生的氧自由基的作用。本实验使用门冬酰胺酶联合自噬抑制剂氯喹处理A549和H1975细胞,或者门冬酰胺酶单独处理两株肺腺癌细胞,48h后Mitosox染色标记线粒体氧自由基的产生。同门冬酰胺酶单独处理组相比,氯喹和门冬酰胺酶联合处理组能观察到信号更强的红色荧光,实验结果提示抑制自噬能增强门冬酰胺酶诱导肺腺癌细胞产生的氧自由基。实验结论综上所述,门冬酰胺酶对肺腺癌细胞具有明显的细胞毒性和诱导细胞凋亡的作用。门冬酰胺酶能引起肺腺癌细胞发生细胞自噬,并且抑制细胞自噬可显著提高门冬酰胺酶对肺腺癌细胞的细胞毒作用。此外,氧自由基也介导了门冬酰胺酶对肺腺癌细胞的杀伤作用。