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尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase-type plasminogen activator， uPA)，简称尿激酶。从细胞中分泌、释放出的尿激酶具有低活性，称为尿激酶原(pro-uPA)，它有三个结构域：类生长因子功能区(growth factor-like domain，GFD，5-49aa)，环状结构域(Kringle domain，KD，50-131aa)，蛋白酶功能区(protease domain，PD，159-411aa)。单链的uPA内Lys158-Ile159肽键经酶切割后，成双链的、具有活性的尿激酶；活性的uPA催化纤溶酶原，活性的纤溶酶也可催化pro-uPA。在细胞表面，uPA以高度的亲和性结合到位于迁移细胞前端的受体上(uPAR/CD87)，降解胞外基质中的蛋白质及细胞基膜的组成成分，在细胞迁移时，uPA结合到位于细胞迁移前端的uPAR上，使位于细胞迁移方向上的胞外基质中的蛋白质水解，破坏细胞间的连接和胞间基质。uPA-uPAR复合物可以激活胞内的信号传导系统。uPA及其受体系统同肿瘤的浸润、肿瘤的恶化、病原体的入侵等病理过程密切相关，具有重要的临床意义，uPA系统是抗癌药物作用的一个有效靶点。本实验的目的是通过结晶学的方法得到uPA的ATF、B链催化结构域突变体结构及B链-benzamindine、-phenylguanidne、-upain-1的三维结构进而解析对uPA的作用机理。
1.尿激酶N-端ATF片段的表达及初步结晶学
尿激酶的N-端ATF片段参与uPA许多生理过程，如：与受体结合和趋药性等。为仔细研究ATF片段的功能及结构一活性相互作用，本文用PCR方法扩增uPAN-端ATF片段，将其克隆至表达载体pPICZαA上，转化酵母X-33，zeocin筛选高拷贝。重组蛋白通过阳离子琼脂糖柱SPFF纯化，纯度达到50％，上凝胶过滤柱Superdex75HR10/30纯化，纯度95％以上：通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测得ATF蛋白的肽段质量指纹谱(PMF)识别鉴定蛋白质；通过与受体结合测定ATF活性，ATF无需激活即具有活性。结晶ATF，其衍射分辨率达3.2A。该晶体属于空间群Pl，单胞参数是：a=47.5A，b=64.7A，c=65.4A，α=71.6°，β=92.1°，γ=84.0°。
2.尿激酶B链在毕氏酵母中表达纯化、生物活性测定及结晶
重叠延伸PCR方法扩增尿激酶B链的突变体片段，将其克隆至表达载体pPICZαA上，转化酵母X-33，用zeocm筛选高拷贝数的酵母菌落。重组蛋白通过阳离子琼脂糖柱纯化，纯度达到99％；尿激酶B链突变体(C279A/N302Q)，无需激活即具有尿激酶活性。水汽相扩散法获得蛋白质晶体，其衍射分辨率达1.45A。
3.尿激酶型B链与小分子复合物的晶体结构
尿激酶作用肿瘤细胞的入侵和转移，所以成为癌症治疗的一个靶分子。三维X-射线结构即提供药物分子设计信息，又可阐述抑制机理。本文为研究活性位点195位Ser突变前后与抑制剂相互作用变化。表达了无活性尿激酶B域突变体(C122A/N145Q/S195A)及活性B域突变体(C122A/N145Q)。分别结晶不同形式的B域、及其与小分子复合物：苯甲醚和苯胍盐。比较了小分子与uPA、组织型尿激酶激活剂(tPA)及胰肮酶(trypsin)的相互作用和接触面积，阐述了它们的抑制能力大小。其中，无活性的uPA B链突变体的晶体结构为其与一系列底物复合物品体结构的获得提供基础；也为以底物的有效药效团为基础设计高效、专一的uPA药物提供便利。
4.多肽upain-1对尿激酶专一性抑制的结构研究
尿激酶是体内纤溶系统中的重要组成部分，参与体内细胞的移植、入侵、分芽增殖和转移等多种生理活动。专一性抑制uPA活性已被证明能够阻碍肿瘤侵袭和转移。本文用气相扩散法结晶活性的尿激酶B链与upain-1的复合物，衍射至2.14A，单胞参数为a=b=120.48A，c=42.4sA，α=β=90.0°，γ=120.0°，R3空间群。结果分析如下：特点之一 uPA的活性位点附近有很大的空洞，有利于浸泡抑制剂。upain-1是由12个氨基酸组成的环状多肽，对尿激酶有专一性和较强的抑制作用(Ki=500 nM)。晶体结构显示upain-1的6-9和9-12位形成紧密β回状结构；其7位Glu与自身的4、5、6位的主链形成三个氢键，稳定upain-1的结构。upain-1除了结合尿激酶的S1和S2位点，也结合尿激酶的60-loop区；故此，诠释了upain-1抑制uPA的专一性。upain-1存在尿激酶所识别且能切割的肽键(Arg4-Gly5)，而它却是uPA的抑制剂，不是底物，结构分析如下：1)upain-1的3位Trp空间位阻，使其4位Arg的羧酸基团远离uPA的195位Ser；2)upain-1的7位Glu与自身的4位Arg主链有强氢键作用，阻止后者与uPA活性位点195位作用；3)upain-1的7位Glu侧链末端占据氧空洞。分析这些复的晶体结构，本文提出了一个对尿激酶(uPA)有专一性、高亲和性的药效团(-Arg-Gly-Leu-Glu-Asn-)，方便开发对尿激酶具有新功能的抑制剂药物分子。