论文部分内容阅读
目的： 金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是一种常见的革兰氏阳性致病菌,更是医院感染中最常见的病原菌之一。可引起人和动物的局部化脓性感染、肺炎、伪膜性肠炎、心包炎以及败血症、脓毒败血症等。金黄色葡萄球菌主要通过产生多种致病因子而致病,这些致病因子包括溶血素、杀白细胞素、肠毒素、凝固酶、耐热核酸酶、溶纤维蛋白酶、透明质酸酶以及细胞壁结构荚膜、蛋白A等。近年来,由于金黄色葡萄球菌耐药菌株的不断出现,尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MethicillinResistantStaphylococcusaureus)的出现,可抵抗大多数临床上应用的抗生素。这就更加促进了人们对金黄色葡萄球菌致病的分子机理和新的防治措施进行研究。 本课题通过对MRSA的CHIPS基因进行扩增、克隆、序列分析、生物信息学分析、原核表达、纯化及初步的免疫学功能研究,为检测试剂盒和疫苗的研发奠定基础。 方法： 根据GenBank中CHIPS的序列,设计一对特异性引物,以MRSA的DNA为模板PCR扩增CHIPS基因,PCR产物纯化后与pMD18-T载体连接,连接产物转化大肠杆菌E.coliDH5a,挑选阳性菌落提取质粒进行EcoRI、XhoI双酶切鉴定及测序鉴定,然后再将CHIPS亚克隆入表达载体PET-28α,转化感受态大肠杆菌BL21,对质粒进行双酶切鉴定、基因序列比对和生物信息学分析,用IPTG诱导表达重组蛋白,His标签单克隆抗体进行免疫印迹验证重组蛋白的表达。对表达的蛋白进行纯化,使用纯化后的蛋白包被ELISA板,用ELISA法检测金葡感染病人的血清标本,然后进行统计学分析。 结果： 以MRSA临床儿童分离株基因组为模板,成功扩增出CHIPS基因,基因大小为450bp;重组PET-28a(+)-CHIPS双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示CHIPS在正确读框中。序列比对分析显示其与相关报道核苷酸序列一致性达99％。生物信息学分析显示,CHIPS开放阅读框长450bp,编码149个氨基酸,预测分子量为17.0kDa,等电点为9.98。成分最多的氨基酸为赖氨酸(K15.4%),亮氨酸(L10.1%),苏氨酸(T10.1%)。无二硫键形成,无磷酸化翻译后修饰位点,无糖基化翻译后修饰位点,无跨膜区,无三级结构。经IPTG诱导后,在相应分子量17kDa可见融合蛋白,与预期分子量相符,免疫印迹检测到目的蛋白。使用Ni2+-NTA纯化柱纯化上清的目的蛋白,多次纯化仍未得到目的蛋白,后用沉淀切胶纯化得到目的蛋白。ELISA的抗原性分析显示,金葡感染者血清中的抗体CHIPSIgG水平高于体检者血清(tIgG=3.208,PIgG<0.05),IgM水平无显著性差异(tIgM=0.823,PIgM>0.05)。按感染部位不同进行分组分析,各组IgG、IgM抗体水平无显著性差异。 结论： 成功从儿童分离株MRSA中构建了CHIPS的原核表达系统,并成功在大肠杆菌BL21中融合表达。金葡感染者血清与体检者血清中抗CHIPS抗体的IgG水平有显著性差异。