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伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)是双股线状DNA病毒,其基因缺失苗不仅能有效预防伪狂犬病,而且可作为构建其他活载体疫苗的常载体。目前重组PRV的构建普遍采用同源重组或细菌人工染色体克隆技术,操作过程繁琐,技术难度较大,耗时较长。部位特异重组是由识别特定DNA序列的重组酶介导的遗传重组,其操作相对简单,现已广泛应用于微生物和动植物基因组的改造,其中应用最为广泛的是来源于P1噬菌体的Cre/loxP系统。为了简化重组PRV的构建步骤,本研究根据PRV UL区序列设计两对引物,以PRV Bartha K61疫苗株基因组为模板,用PCR扩增的TK基因片段为同源臂,构建出同源重组载体pMD-TK。同时以真核表达载体pEGFP-N1为模板,将两侧含loxP位点的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因插入pMD-TK,构建同源重组转移载体pMD-TK-EGFP/loxP。用纯化的PRV基因组DNA与同源重组转移载体pMD-TK-EGFP/loxP共转染PK-15细胞,获得了重组病毒rPRV-GFP-loxP,用其感染PK-15细胞后,经荧光显微镜观察显示能感染细胞并表达GFP报告基因。将重组病毒连续稀释后接种PK-15细胞,经过5轮空斑纯化后获得了纯净的重组毒。构建的重组病毒可在Cre酶作用下切除GFP报告基因,获得含单一loxP位点的重组病毒rPRV-loxP,进而通过部位特异重组的方式与目的载体发生重组,使得重组PRV构建大为简化。