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背景和目的药物性肝损伤(Drug induced liver injury,DILI)是最重要的药源性疾病之一,其临床表型复杂,可引起几乎所有的急性、亚急性和慢性肝损伤类型,重者可导致肝衰竭,甚至死亡。在西方国家,DILI已成为急性肝衰竭的重要原因。尽管我国尚缺乏系统的流行病学数据,但药物性肝损伤,甚至是药物性肝衰竭在临床上也屡见不鲜。对乙酰氨基酚(Acetaminophen,APAP)是最常引起固有型DILI的药物,也是欧美国家导致急性肝衰竭的首要病因。虽然对其肝脏毒性的机制已有较多研究,但APAP导致肝损伤(Acetaminophen-induced liver injury,AILI)和急性肝衰竭(Acetaminophen-induced liver failure,AILF)的确切发病机制仍有待进一步阐明,而且,预测其不同临床预后的生物标记物,目前也并不清楚。因此,本研究通过不同剂量APAP分别诱导稳定的小鼠AILI模型和AILF模型,从脂质组学、机制相关生物标记物分析等方面系统分析AILI和AILF的差异,旨在探索可有效预测预后的潜在生物标记物,并对相关机制进行初步探讨。方法采用不同剂量APAP分别诱导稳定的AILI和AILF小鼠动物模型,分别模拟不同预后的疾病模型。使用LC-MS技术对对照组以及两组疾病模型小鼠的血浆和肝脏组织进行脂质组学分析来确定各组动物模型的血浆和肝脏内脂质代谢特征及水平差异。根据脂质组学代谢差异,通过PCA、PLS-DA和OPLS-PCA等多维统计分析方法,在AILI和AILF组中筛选出差异代谢的脂质成分,进一步利用T test和VIP(VIP>1且P<0.05)等分析方法,筛选对照组和AILI组间肝脏组织和血浆中差异表达的脂质分子,寻找具有潜在诊断、预测预后价值的脂质分子。使用RT-PCR、western-blot等分子生物学技术初步对AILI动物模型中PC和PE等脂质分子差异变化的可能因素进行探讨。通过EILSA、RT-PCR以及Western Blot等技术对AILI和AILF组动物模型中的机制相关生物标记物进行分析比较,旨在探索机制相关的生物标记物在预测疾病预后方面的价值。采用生物信息学分析技术对已有的DILI的miRNA和mRNA数据库进行分析,建立miRNA与mRNA间的调控网络,通过文献检索和RT-PCR技术对调控网络进行验证,发现Egr-1在AILI模型中早期显著变化。通过构建Egr-1的过表达和干扰腺病毒,干扰Egr-1在细胞和动物模型中的转录表达,分析Egr-1在AILI动物模型中的作用和意义。利用生物信息学分析找出Egr-1下游靶基因Gadd45,利用CRISP/Cas9技术敲除肝癌细胞系中Gadd45基因的a亚型,验证Egr-1是否通过调控Gadd45在AILI动物模型中发挥适应性保护作用。结果1.本研究通过小鼠腹腔注射300 mg/kg或750 mg/kg不同剂量的APAP,构建了稳定的AILI和AILF动物模型。与对照组相比,AILI和AILF组的转氨酶均显著升高(P<0.05)。AILI组在6h时,血浆ALT水平达到峰值,AILF组12h时,血浆ALT水平仍显著上升(P<0.05);AILF组与AILI组相比,12h时,AILF组血浆ALT水平显著高于AILI组(P<0.05)。肝脏组织学结果可见对照组肝细胞结构和形态正常,无肝窦淤血;与对照组相比,AILI和AILF组均表现为典型的中央静脉周围肝细胞坏死;AILF可见典型的急性肝衰竭病理表现-急性大块性肝坏死特点,且AILF组肝脏组织HAI评分显著高于AILI组(P<0.05)。2.与对照组相比,AILI组和AILF组血浆中脂质分子代谢发生显著差异。1h时,AILI组血浆中TAG 50:1、TAG 50:4以及TAG 50:5等3种脂质成分较AILF组显著下降,提示具有早期预测预后的潜在价值;PE 38:6、PE 34:2、PE 36:4、PE 38:4、FFA 22:6、TAG 48:2、TAG 48:3和TAG 54:5等脂质分子的改变在3h时,可明显区分AILI组和AILF组,也提示具有预测预后的潜在价值。3.通过比较AILI组和对照组的磷脂分子的变化,通过多种筛选方法最终筛选出PC 32:2,PC 34:3,PC 34:2,PE 34:2,PE 36:3,PE 38:4,PE 38:6等7种磷脂分子在AILI动物模型中显著升高,可能具有诊断AILI的潜在价值。与对照组相比,肝脏组织磷脂酶中除Pla2g12a外,其他磷脂酶(PLA1(Pla1a),PLA2(Pla2g6,Pla2g7,Pla2g12b,Pla2g15,Pnpla2,Pnpla7,Pnpla8),PLC(Plcg1,Plcxd2),PLD(Pld3,Pld4))的转录水平均明显下降(P<0.05)。与对照组相比,AILI组磷脂合成相关基因Pemt转录下调,而Chka的转录和表达均显著升高,Chka的转录在6h时达到峰值,Chka的蛋白表达的峰值在12h。4.机制相关生物标记物的研究发现:与对照组相比,AILI和AILF组肝脏中ROS从1h开始,各时间点均可见显著升高(P<0.05);且1h时,AILF组ROS的生成量显著高于AILI组(P<0.05)。AILI组COX1在6h时显著升高,而对照组和AILF组均未见显著升高。与对照组相比,3h时,AILI组和AILF组可见CYTB、COX2和ATP8显著降低(P<0.05);6h时,COX1、ND1、ND5和ATP8转录水平显著降低(P<0.05);12h时,NADH的其他亚基均可见显著降低(P<0.05)。AILI组与AILF组相比,6h时,AILF组COX1显著高于AILI组(P<0.05),而ATP6的转录水平显著低于AILI组(P<0.05)。12h时,AILF组的肝脏中CYTB、COX2、ATP8以及NADH的2、3、5和6亚基的转录水平显著低于AILI组(P<0.05)。与线粒体损伤相关的血浆生物标记物GLDH在AILI组早期可见显著升高(P<0.05),AILF组GLDH血浆水平高于对照组,但升高水平显著低于AILI组;AILF组中SDH的血浆水平各时间点均显著高于对照组,AILI组无显著改变。坏死相关生物标记物中,AILI组HMGB-1在AILI组中较对照组显著升高(P<0.05),而在AILF组中无显著改变。CK-18 M65在AILI组和AILF组血浆中均显著高于对照组(P<0.05),M30的血浆水平均低于对照组(P<0.05);AILF组血浆M65水平显著高于AILI组(P<0.05)。炎性因子TNF-a、IFN-r、IL-6及IL-10在AILI组和AILF组中均较对照组显著升高(P<0.05),且AILF组炎性因子的升高更显著。CyclinD1和PCNA等与增生相关的标记物在肝脏中转录和蛋白表达与对照组相比,可见显著增加(P<0.05)。5.AILI动物模型中Egr-1的转录水平以及血浆含量均在1h显著升高,6h达到高峰。免疫组化结果显示,Egr-1在肝脏组织中阳性表达。Egr-1的下游基因Gadd45的3个亚型在AILI动物模型肝脏中转录改变与Egr-1具有类似的变化谱;通过腺病毒过表达动物模型和原代肝细胞的Egr-1,APAP处理高表达Egr-1的动物和细胞,转氨酶和LDH显著低于对照组;原代肝细胞干扰Egr-1后,再用APAP处理,肝细胞上清中LDH水平明显高于未干扰的对照组;通过CRISP/Cas9技术敲除肝癌细胞系的Gadd45a基因,再用APAP处理后的细胞,上清中LDH水平显著高于对照组。结论差异代谢的脂质成分对预测AILI和AILF的不同预后具有潜在价值。AILI动物模型中PC和PE的变化可能与磷脂酶、磷脂合成基因的转录表达变化有关。线粒体损伤(ROS、mtDNA、GLDH及SDH)、细胞坏死(CK18-M65、HMGB-1)、炎症(TNF-a、IFN-γ、IL-6和IL-10)以及肝细胞增生(Cyclin D1、PCNA)等生物标记物在AILI和AILF两组动物模型中改变具有显著差异,对预测AILI和AILF的不同预后具有潜在价值。Egr-1在AILI动物模型中可能通过上调Gadd45a发挥适应性保护作用。