目的：本研究旨在探索制作天然脱细胞角膜基质的方法和可行性，为组织工程提供理想的载体材料和眼表组织修复提供理想的修复材料。通过应用表面活性剂(十二烷基磺酸钠SDS及TritonX-100)和磷脂酶A2(PLA2)处理猪角膜组织，以不同浓度和作用时间分组，确定能够脱去角膜各层内的细胞同时可以最大限度保持角膜基质空间结构的处理条件作为合理的角膜脱细胞作用条件；通过对完成脱细胞的角膜基质其物理学特性及生物学特性的检测，探讨脱细胞基质作为角膜组织工程支架材料的可行性及安全性；将脱细胞基质植入兔角膜层间，观察术后角膜透明性的恢复，探讨该种基质作为角膜修复材料的有效性及其具体的作用机制，最终为眼表损伤的治疗提供科学的实验依据。 方法: 1.借助阴离子表面活性剂进行猪角膜脱细胞基质的制备及最佳处理方案的确定：取新鲜猪角膜若干，分别用SDS及TritonX-100处理，共分为四组：实验一组(脱细胞真皮ADM—CACM组)—借鉴真皮组织脱细胞的方法对角膜进行处理；实验二组(TritonX-100组)一单独使用TritonX-100处理角膜片，溶液浓度设定为0.1％、0.25％及0.5％，作用时间为6小时、12小时及24小时；以不同的浓度及作用时间进行组合，共分为9组；实验三组(SDS组)——室温下使用SDS处理角膜，溶液浓度设为0.05％、0.1％及0.5％，作用时间6小时、12小时、24小时，亦分为9组；实验四组—根据对上述实验三组结果的观察，选择浓度为0.1％SDS在37℃下分别作用2-9小时，每1小时作为1个观察点，共分为8组；组织学检查显示以浓度为0.1％的SDS溶液在37℃处理7小时后，角膜原有的三维显微空间结构保留良好，基质片内无细胞成分残留；遂以此处理条件得到的脱细胞角膜片(SDS—CACM组)进行后续检测； 2.脱细胞角膜基质物理学特性的鉴定：从SDS—CACM，ADM—CACM，PBS—CACM三组中，每组随机抽取相同厚度的12只角膜基质片，分别将三组植片固定于紫外—可见光谱仪密闭的样品仓中，选择250nm—800nm作为观测的波长范围，连续测定两组植片的透光率；每组随机抽取24只角膜基质，置于50℃烘箱里烘干24小时，电子天平测其恒重G，后浸入PBS缓冲液，在角膜片吸水后的不同时段取出，称重为G1；吸水率测量分为二组，每组12只。第一组测量时间持续2小时，每间隔10分钟测量1次；第二组测量持续时间12小时，每间隔1小时测量1次，计算吸水率；上述三组角膜片按1c㎡试样表面积加10mL细胞培养液的比例在37℃的培养箱内浸提24小时，用MTT法评价各组植片对细胞生长活性的影响。 3.脱细胞基质力学特性的鉴定：模拟正常角膜的结构制作力学模具，从SDS—CACM，ADM—CACM，PBS—CACM三组和空白组中每组随机抽取12只角膜基质，通过充气—破裂实验的结果，选择SDS—CACM，PBS—CACM和空白组角膜片每组12只进行应力—应变实验，将拍摄所得数据输入电脑，测量并计算逐渐加压后角膜中央区标记范围内的面积变化，计算在5、15、30、50mmHg压力差(P’)时角膜片面模量(E)的变化，分析并比较不同组别角膜植片的应力—应变关系的差异。 4.异种角膜基质层间植入术后透明性的恢复：成年新西兰大白兔60只，SDS—CACM组脱细胞角膜片30只，实验组30只眼，右眼行角膜基质层间异种材料植入手术，阴性对照组30只眼，右眼仅行角膜基质板层分离术。异种植片植入术后每日以裂隙灯观察术眼眼表情况、切口处的恢复以及脱细胞植片和宿主角膜透明度的恢复。于术后1周、2周、3周、4周随机处死实验组及对照组每组各20只兔子，制成石蜡标本行光学显微镜观察，监测术后植片与宿主的生物相容性及透明度变化。取上述两组石蜡标本制成6μm切片，行天狼星红-苦味酸染色，偏光显微镜下观察术后1-4周宿丰角膜基质与植片角膜基质内Ⅰ型及Ⅲ型胶原的数量变化，定性分析两种类型胶原在角膜创伤修复过程中的动态演变。异种植片植入术后1月、4月、7月及11月，处死动物实验组及对照组每组剩余的10只兔子，取其术眼行透射电子显微镜观察植入术后胶原纤维板层的排列情况，计算移植术后胶原纤维的直径及纤维之间的间距变化。 5.利用磷脂酶制作猪角膜脱细胞基质：制备碳酸盐缓冲液及脱细胞溶液Ⅰ(含PLA2及脱氧胆酸钠的碳酸盐缓冲液)和脱细胞溶液Ⅱ(仅含PLA2的碳酸盐缓冲液)。用含抗生素的碳酸盐缓冲液清洗角膜，后转移至纯水中浸泡1小时。37℃水浴震荡下，浸入脱细胞溶液Ⅰ处理6小时。后经碳酸盐缓冲液冲洗，用脱细胞溶液Ⅱ处理2小时。最后再以碳酸盐缓冲液清洗样本，4℃无菌条件下保存备用。 结果: 1.借助脱真皮细胞的方法处理猪角膜后，角膜高度水肿，透亮度显著降低，虽细胞可被完全脱去，胶原板层结构却遭到很大程度的破坏；经不同浓度的TritonX-100处理后，角膜内的细胞即使是作用24小时之后仍有残留；较高浓度SDS(0.1％和0.5％)在室温下处理的角膜虽在24小时后细胞可完全脱去，但角膜的胶原板层结构亦受到严重破坏，而低浓度0.05％的SDS却无法将角膜内的细胞完全脱去。 2.提高处理溶液温度至37℃作用7小时后，浓度为0.1％的SDS即可将角膜基质片内的细胞完全脱除，而同时原有的三维显微空间结构仍保留良好，因此选取该实验条件作为后续角膜脱细胞的方法，并对该方法制作的角膜片(SDS-CACM组)进行深入的检测； 3.与脱真皮细胞方法制作的角膜相比，通过SDS处理的角膜水肿较轻，透亮度尚存，胶原板层排列尚规则，基质表面光滑、完整； 4.与PBS-CACM组角膜片相比，经脱细胞处理后的SDS-CACM组和ADM-CACM组角膜片，其透明性均明显降低，而以ADM-CACM组为甚。表明经不同脱细胞处理后，角膜内透明质酸钠的含量均有所降低；本实验中猪角膜的平均吸水率约为80.68±3.01％。无论是2小时组还是12小时组，角膜片均在吸水后的第一个小时内达到最快的吸水速度，之后吸水率增长的速度逐步减慢，脱细胞处理后的两组角膜其增速减慢的程度较PBS—CACM组更为明显。随着时间的推移，脱细胞处理组的吸水率较PBS—CACM组明显下降，表明透明质酸钠的数量经脱细胞处理后有所下降。吸水2小时后，经脱细胞处理的两组角膜片其吸水率未见明显差别，而吸水12小时之后，ADM—CACM组的吸水率较SDS—CACM组明显下降，表明经脱真皮方法处理的角膜其透明质酸钠的丢失更为明显。 5.在2天的观察期内，与传统的培养液相似，L929细胞可在脱细胞角膜基质的浸提液中保持良好的生长状态，说明该浸提液对体外生长的细胞无毒性作用。 6.充气—破裂实验中，当推注气体至自动注射器达50mmHg时，ADM—CACM组角膜即发生破裂，而SDS—CACM组和PBS—CACM组角膜片却可以保持结构完整直至充气至最大压力300mmHg；与新鲜角膜相比，经脱细胞处理后的角膜片其面模量均明显减小，而两组脱细胞角膜片之间并无统计学差异。 7.术后4周，实验组术眼植片恢复完全透明，眼表整洁，无感染及炎症反应出现；对照组角膜于术后3天恢复完全透明，亦未见炎症反应、新生血管形成及免疫排斥反应发生；病理切片观察，实验组术后1周内组织水肿明显，第4周时可见宿主基质细胞逐渐爬行至植片。 8.在接近1年的观察期内，处理组角膜植片稳定的存在于宿主角膜基质层间，呈现出良好的生物相容性。透射电子显微镜图片显示，在术后1个月、4个月、7个月及11个月时，植片胶原纤维直径与术前相比未发生变化，纤维之间的间距介于之间，这种胶原纤维的空间结构保证了术后角膜的透明度得以长期保持。 9.猪角膜片经磷脂酶及脱氧胆酸钠处理后，HE染色显示角膜基质中无任何完整的细胞和细胞碎片，基质板层结构完整、规则。 结论: 1.脱真皮细胞的方法直接用于处理角膜虽可完全去除各层的细胞，但同时亦会引起其基质结构及蛋白多糖成分的改变，进而影响角膜的透明度及其力学性质； 2.单纯使用TritonX-100对角膜进行脱细胞处理，在一定浓度和作用时间内并不能达到理想的脱细胞效果，或可同时使用其它试剂以增强其脱细胞的能力； 3.以浓度为0.1％的SDS溶液在37℃处理7小时后，角膜原有的三维显微空间结构保留良好，基质片内无细胞成分残留；该处理条件可用于针对角膜的脱细胞方法；同样，经磷脂酶A2和脱氧胆酸的序贯处理，亦可获得理想的脱细胞角膜基质； 4.应用SDS制作的脱细胞角膜基质片生物相容性良好，保留了正常角膜的超微结构和具有良好的视光学及生物力学特性，有可能成为构建组织工程角膜的合适支架材料，并用于移植治疗角膜基质缺损性疾病。