【摘 要】
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该课题做了以下具体工作:选取确诊的DCM患者8名以及健康供血者30名,以人β-肾上腺素能受体细胞外第二环26肽(β-ARECⅡ,197-222)为抗原肽,以辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG
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该课题做了以下具体工作:选取确诊的DCM患者8名以及健康供血者30名,以人β<,1>-肾上腺素能受体细胞外第二环26肽(β<,1>-ARECⅡ,197-222)为抗原肽,以辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG为二抗,OPD为显色剂,进行ELISA,于酶标仪测定OD<,492>nm值,以大于2.5倍阴性OD值为阳性,得到5名抗人β<,1>-AR自身抗体阳性DCM患者.按常规方法从抗体阳性的DCM患者约50ml外周血中分离淋巴细胞,按TRIZOL试剂说明书操作提取总RNA25μg,OD<,260>/OD<,280>值为2.0,电泳示RNA完整,没有降解.并以此为模板,Oligo(dT)<,20>为逆转录引物,在逆转录酶ThermoScript的催化作用下,合成cDNA第一链.以cDNA第一链为模板,分别用κ段3端引物和5端引物;λ段3端和5端引物;IgG<,1>3端引物和VH1a+VH3a;IgG<,1>3端和VH1f+VH3f引物;IgG<,3>3端和VH1a+VH3a引物;IgG<,3>3端和VH1f+VH3f引物扩增目的基因(共6对).PCR反应条件为:94℃ 5min;94℃ 1min,58℃ 1min,72℃ 2min,35cycles;72℃ 10min,分别扩增出重链Fd段和κ、λ两轻链基因片段.琼脂糖凝胶电泳示在约650bp处可见明显的扩增条带,与理论值相符.结论:1.从抗人β<,1>-AR自身抗体阳性的DCM患者外周血淋巴细胞中提取细胞总RNA,成功扩增出重链Fd段和轻链基因,并将其分别克隆到同一表达载体pComb3中,构建了库容量为1.4×10<6>Fab段噬菌体抗体库.2.从库中筛选到特异性抗人β<,1>-AR Fab段噬菌体抗体阳性克隆,竞争性抑制实验证实具有高度的特异性.3.对阳性克隆序列进行分析表明κ轻链V、J基因可能分别起源于Vκ1和Jκ4亚群;重链V、D、J基因可能分别来自VH3-49,D1-26和JH5亚群.4.将阳性重组噬粒的gⅢ部分去除后,经IPTG诱导,成功表达了可溶性抗人β<,1>-AR Fab段抗体.
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