论文部分内容阅读
人Survivin基因是美国教授Altieri D.C.在1997年利用RT-PCR方法从人乳腺癌细胞中获得的。Survivin蛋白作为凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族的一个成员,是含有70个氨基酸的杆状病毒IAP重复序列(Rod baculo virus IAP repetitive sequence, BIR)。 Survivin蛋白在正常细胞中极少表达,而在癌细胞中大量表达的独特性质使其成为了一个研究热点。因为它既可以作为癌症治疗过程中预后不良的标志,也有希望成为新的抗癌靶标。Survivin蛋白突变体Survivin (T34A)是Survivin蛋白的显性负性突变体,它能够逆转Survivin的抗凋亡作用,促进癌细胞死亡。但是由于其透过细胞膜的能力有限,因此我们实验室在此突变基础上构建了带有穿膜肽(Trans—activating transcriptional activator, TAT)的Survivin突变体TAT-Surivin(T34A)基因,并成功使其在大肠杆菌中表达,简称TmSm蛋白。本论文主要内容是对TmSm蛋白进行表达纯化及质量和药效学检测。(1)利用10L的发酵罐发酵,菌体湿重可达160克,目的蛋白表达量可以达到菌体总蛋白的35.5%。用高压均质机在800mpa的压力下破碎大肠杆菌发酵液,10000转冷冻离心,得到包涵体40克,纯度达80%。(2)利用30L的发酵罐发酵,菌体生长密度最高达30.6OD。发酵湿菌体收率达27～31g/L,目的蛋白表达量为菌体总蛋白的30～32%。在30L罐上重复发酵3批,控制工艺与结果基本稳定。对包涵体进行了洗涤,纯化和复性,最终获得了纯度大于95%的10g可供下一步实验用的TmSm蛋白。(3)在纯化工艺优化的基础上按照国家药典的要求对TmSm蛋白的分子量、肽图、C/N末端氨基酸、紫外吸收光谱、RP-HPLC纯度、宿主菌体蛋白残留、内毒素含量、外源DNA残余量、大鼠溶血性检测试、粉针剂免疫原性等进行了检测,均符合国家药典的要求。(4)在前期的细胞实验基础上对五种常见肿瘤细胞B-cap-37、 MCF7/ADR SW1990、 A549进行了促凋亡实验,证明TmSm蛋白对上述肿瘤细胞都有较好的促凋亡效果。(5)在实验室成功建立人乳腺癌细胞B-Cap-37细胞的BALB/c-nu小鼠模型的基础上,初步进行了小鼠体内药效学检测。实验发现TmSm实验药物组的瘤体的体积大小和重量明显小于对照组。证明了TmSm蛋白能够有效杀伤本小鼠模型动物体内的肿瘤细胞。