维生素B6(VB6)是一种水溶性维生素,也是一类毗啶化合物的总称,2-甲基-3-羟基-5-羟甲基吡啶是它们共同的母体,吡啶环第四碳位被羟甲基、氨甲基、甲酰基取代后分别形成吡哆醇(Pyridoxine, PN)、吡哆胺(Pyridoxamine, PM)和吡哆醛(Pyridoxal,PL),三者相应磷酸酯形式为磷酸吡哆醇(Pyridoxine-5’-phosphate, PNP)、磷酸吡哆胺(Pyridoxine-5’-phosphate, PMP)和磷酸吡哆醛(Pyridoxal-5’-phosphate, PLP),其中PLP是VB6的主要辅酶形式。PLP是氨基酸代谢过程中多种酶的重要辅酶,参加催化氨基酸的各种代谢反应,在氨基酸的合成、分解和转换代谢中具有重要作用。PLP的生物合成方式包括从头合成途径和补救途径两种。补救途径中磷酸吡哆醇氧化酶(Pyridoxine-5’-phosphate oxidase, PNPO)发挥关键作用。PNPO在黄素单核苷酸(Flavin mononuleotide, FMN)和O2存在下,可氧化底物PNP和PMP上的醇基或氨基为醛基,生成PLP。家蚕是鳞翅目昆虫基因组和基因研究的主要模型,也是仅次于果蝇作为昆虫基因研究的代表。家蚕的功能基因研究不仅有助于阐明同源基因的功能,而且将推动有关昆虫的驯化、形态发生、内分泌、繁殖、行为和免疫等研究进程。在家蚕体内丝蛋白的合成和生长发育的过程中,VB6代谢是其中一个重要环节。PNPO是仅有的可以将氨基或醇基氧化成醛基的黄素蛋白氧化酶,在VB6的代谢过程中,可能是一个关键控制点。本文以本实验室保存的家蚕PNPO cDNA为研究对象,分别对Lys111和Ser160进行定点突变,将赖氨酸突变为谷氨酸,记为K-E；丝氨酸突变成丙氨酸,记作S-A。通过重组表达和体外酶活测定,鉴定该位点的功能。家蚕重组PNPO突变体经SDS-PAGE检测蛋白分子量约在45.0 kDa,与突变前的蛋白分子量一致。经体外酶促反应测定,K-E突变体的酶活性降低了约78.0%；S-A突变体酶活性降低了约67.4%。本研究明确了家蚕磷酸吡哆醇氧化酶个别保守氨基酸残基的酶学功能。