大豆(Glycinemax(L.)Merrill)是属于豆科、蝶形花亚科、大豆属的二倍体(2n=40)植物，是人类植物性蛋白质的主要来源之一，又是重要的饲料和工业原料。借助分子生物学和遗传学方法研究大豆的功能基因将有利于提高大豆产量、品质以及抗性。基因的转录表达在植物生长、发育和适应环境等生命活动中起着极其重要的作用，植物体基因组中编码了大量转录因子来调控基因的转录，例如，植物基因组中的AP2/ERF,WRKY,ARF和NAC（NAM，ATAF1，CUC2）等转录因子家族。然而仅对基因的转录水平进行调控，仍然不能实现对相应生命过程的精确控制，还需要对包括基因的转录在内的信号级联反应途径中的不同阶段在时间和空间上进行准确地调控，例如蛋白翻译、蛋白修饰等。其中蛋白泛素化修饰是真核生物中特有且重要的蛋白翻译后修饰过程，广泛地参与了对有机体生理活动的调控。　　本文拟通过鉴定、克隆和分析大豆中的NAC转录因子和RBR(RING-IBR-RING)泛素连接酶基因以及其功能，为大豆基因转录调控和蛋白泛素化修饰的研究提供基础。通过系统进化、蛋白序列及结构分析的方法对包含三种豆科植物在内的NAC和RBR家族蛋白进行分析，研究豆科植物（特别是大豆）中NAC转录因子家族和RBR家族的进化特点。并利用组织表达、启动子分析、原生质体瞬时表达、酵母单杂交、以及异源表达等方法对鉴定到的5个NAC转录因子和11个RBR基因做了初步的分析，为进一步研究两个家族基因在细胞信号传递过程中的功能奠定基础。　　一、NAC转录因子是植物中特有的一类转录因子，参与了植物的生长发育、对非生物胁迫的响应、细胞凋亡、组织衰老和营养物质的转运等多种生理活动。本中心（国家大豆改良中心）研究人员从栽培大豆94-16的子叶折叠突变体中克隆的一个在根和叶片中上调表达的NAC基因，序列与NCBI数据库中的GmNAC28(EU661925)相同，但该基因的功能并不清楚。本文从大豆94-16中克隆到4个新的编码NAC家族蛋白的基因，分别命名为GmNLP1（GlycinemaxNAM-likeProtein1）-GmNLP4，并对包括GmNAC28在内的这5个基因进行了组织表达分析、启动子分析以及转基因等研究。　　1.通过对Phytozome等数据库中NAC家族蛋白序列搜索与分析，发现编码NAC家族蛋白的基因存在于除两种藻类以外的其它植物中，获得包括大豆在内的三十种植物的2676条NAC家族蛋白序列。对不同物种基因组中编码NAC家族蛋白的基因的分析表明，被子植物中由于基因重复造成NAC家族基因数量增加。对豆科（大豆、蒺藜苜蓿和菜豆），十字花科（拟南芥和油菜）和禾本科（水稻、玉米和谷子）的1109条NAC家族蛋白的系统进化分析表明，NAC家族蛋白可以划分为八个不同的亚家族(Ⅰ～Ⅷ)。其中编码亚家族Ⅷ的基因在豆科植物缺失。对NAC家族蛋白的序列结构分析表明各亚家族NAC结构域之间存在明显的差异，而在族内则表现保守。GmNLP1-GmNLP4和GmNAC28与CUC2，NACl等蛋白被聚在家族Ⅰ，并具有保守的DNA结合和二聚体形成必须的氨基酸残基。拟南芥NAC转录因子家族Ⅰ的基因参与顶端生长组织形成、子叶分离、叶片形态形成、植株衰老、以及侧根形成等生理过程，因此推测在大豆中家族Ⅰ的基因GmNLP1-GmNLP4及GmNAC28可能具有类似的功能。对五个基因编码的蛋白序列的分析表明，GmNLP1和GmNLP2蛋白之间的相似性为92.0％，GmNLP3和GmNAC28蛋白之间的相似性为76.6％。而其它三个基因之间以及与GmNLP1或GmNLP2的蛋白序列之间的相似性均不超过60％。　　2.GmNLP1-GmNLP4和GmNAC28基因在大豆根、茎、叶、花以及种子中的组织表达分析表明:GmNLP1和GmNLP2基因在大豆的根、花和种子等组织中表达，但GmNLP2基因在根部的表达水平较GmNLP1基因高而在花中则较低;GmNLP3基因在根、茎、花和种子表达，其中在根中具较高的表达水平;GmNLP4基因特异性地在根和花中表达，且表达水平比较低;GmNAC28基因在所有研究的组织中均有表达，但在根和种子中的表达水平比较高。对种子发育过程中5个基因的表达分析表明GmNLP1-GmNLP3和GmNAC28基因的表达持续了种子发育的整个过程，但未检测到GmNLP4基因在种子中的表达。GmNLP1和GmNLP2基因的表达水平随种子发育提高，但在不同的时期出现了峰值。GmNLP3基因在种子发育过程中持续较高的表达水平。　　3.拟南芥原生质体瞬时表达结果证明5个NAC编码的蛋白均定位于细胞核中;酵母转录激活活性试验表明5个基因都具有转录激活活性，证明5个基因是作为转录激活因子参与细胞核中基因转录的调控。同源基因或者具有相似结构的基因往往具有相似的功能。本研究通过异源表达方法对克隆的大豆NAC基因在形态发生（植物器官形态建立）等生理过程中功能进行研究。转化拟南芥及其NAC家族基因功能缺失突变体的结果表明，未观察到过量表达5个NAC基因的转基因拟南芥植株在生长发育过程中出现叶片、花以及荚果等器官明显的形态变化。过量表达GmNLP3和GmNAC28基因的转基因植株未出现提前衰老的现象。在突变体(cuc1-13，cuc2-3)中过量表达GmNLP4基因未能够回复其野生型表型。原因可能为:(1)NAC家族基因的功能冗余，过量表达未必能够引起明显的形态变化;(2)转化的大豆基因与拟南芥突变体基因的功能不同而不能实现功能互补等。因此进一步将大豆内的这些基因沉默也许能够有助于揭示其在大豆中的功能。　　4.进一步分析GmNAC28基因的启动子序列，并通过构建具不同长度缺失的启动子植物表达载体(ProGmNAC28∶GUS)对该基因的表达调控机制进行研究。ProGmNAC28∶GUS研究结果表明GmNAC28基因的表达位于叶缘齿尖、柱头、花瓣与花萼的离层组织、衰老的花丝和雄蕊、以及根冠和根部维管组织中。启动子分析与GmNAC28组织表达分析结果一致，并进一步表明GmNAC28基因可能与大豆组织的衰老相关，在根中作用于根部维管组织。在GmNAC28基因的启动子序列中鉴定到两段功能序列，分别包含一段参与GmNAC28基因转录调控的顺式作用元件，其中的一段序列位于基因上游-1015-1378bp之间，该序列的存在降低GmNAC28基因的表达水平;另一段序列位于+1-253bp之间，该序列是GmNAC28基因表达必须的，缺失导致GmNAC28基因不能够表达。　　二、蛋白泛素化修饰是细胞生命过程中重要的生化过程，在细胞中执行多种重要的功能，例如，蛋白质降解、基因表达调控、细胞信号传递、细胞分化与凋亡。RBR是新发现的含RING结构的一类蛋白，其中很多RBR具有泛素连接酶功能。动物中的研究表明该家族的成员参与了多种重要的生理活动，但对该家族在植物中具体的功能还很少报道。　　1.在大豆基因组中鉴定到24个编码RBR结构域蛋白的基因，其中八个基因编码的蛋白序列存在大片段缺失。对包含大豆等共32种植物中的651条含RBR结构域的蛋白序列进行了系统进化分析，将这些RBR家族蛋白划分为六个亚家族（ARIADNEA，ARIADNEB，PlantⅠ/Helicase，PlantⅡA/B，PlantⅡC和ARA54）。大豆中RBR家族同样可以划分到上述六个亚家族中。通过分析RBR结构域之外的蛋白序列结构、基因结构进一步证明了上述进化分析结果，ARIADNEA与ARIADNEB、PlantⅡA/B与PlantⅡC亚家族之间在蛋白结构上都表现出了较大的差异。对不同物种中RBR家族的分析表明，六个亚家族中除PlantⅡC和Helicase亚家族仅在被子植物中发现外，其余亚家族也存在于藻类和苔藓类等低等植物中，说明RBR家族出现于藻类与其它种类的植物分离之前。本文从大豆品种NN1138-2中克隆了11个包含有完整RBR结构域的大豆基因，并对它们进行了蛋白结构、基因表达以及功能定位等分析。　　2.克隆的11个RBR基因分别属于ARIADNEA，ARIADNEB，PlantⅠ/Helicase，PlantⅡA/B，PlantⅡC等五个亚家族。对各个亚家族的蛋白序列分析表明，每个亚家族蛋白除具有保守的RBR结构域外，不同亚家族的蛋白序列中还含有独特的蛋白结构域。基因重复使大豆基因组中具有九个PlantⅡC亚家族基因，但序列和表达分析表明只有两个基因是能够表达的功能基因。原生质体瞬时表达结果显示克隆的大豆ARIADNEA，ARIADNEB，PlantⅡA/B，PlantⅡC等亚家族基因定位于细胞核中，推测这些家族基因可能参与细胞核内蛋白的泛素化修饰。蛋白序列分析发现在Heliease和PlantⅡA/B亚家族成员蛋白序列中含有能够与DNA和RNA结合的结构域，说明Helicase和PlantⅡA/B亚家族蛋白在执行细胞功能的过程中需要核酸的参与。通过组织表达分析对ARIADNEA，ARIADNEB，PlantⅡA/B，PlantⅡC等亚家族的11个基因研究表明，这些亚家族的RBR基因在大豆根、茎、叶、花以及发育中的种子等多个组织中均有表达。其中PlantⅡC亚家族基因GmRTRP5表现出与其他10个基因不同的特点，在各种组织的表达水平很低。qRT-PCR表明GmRTRP3-GmRTRP5等基因参与了植物对激素ABA、GA3以及Na+胁迫的响应途径。　　基因转录和蛋白泛素化修饰是调控植物细胞生理活动的两种重要途径。大量研究表明通过对转录因子的蛋白泛素化修饰来调控基因的转录是表达调控的一个重要途径，且已有实验证明NAC家族转录因子中一些成员受到了泛素化修饰的调控，如SINAT5促进NACl蛋白泛素化修饰来抑制生长素信号传递。进一步研究RBR家族基因的功能，以及RBR泛素连接酶是否与NAC转录因子之间存在调控关系，将有利于我们进一步了解蛋白泛素化修饰和NAC转录因子在调控细胞信号传递途径中的功能。