牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)是造成猪、牛、羊和鹿等家畜动物和部分野生动物的牛病毒性腹泻-黏膜病(bovine viral diarrhea-mucosal disease,BVD-MD)的主要病原体。该病毒在全球范围内广泛传播,对畜牧业的健康发展和牛源生物制品(血清和冻精等)质量提高等造成巨大的威胁。但是,目前我国尚无有效的药物和防控措施抵御BVDV感染,其主要原因之一是BVDV持续性感染的分子机制尚未系统阐明。而大量的研究表明细胞自噬和凋亡等信号通路直接影响病毒持续性感染,而且microRNA(mi RNA)也能通过调控细胞自噬和凋亡等信号通路进而影响病毒持续性感染,所以本研究全面探索BVDV、miRNA、自噬和凋亡之间相互作用的分子机制,为阐明BVDV持续性感染的分子机制提供理论依据;同时通过定点突变和反向遗传学技术构建BVDV定点突变株,为研发抗BVDV有效方法奠定了技术和理论支持,也为家畜的抗病育种工作提供新的方法和理论依据。目的:本研究以BVDV标准株NADL为研究对象,探索BVDV NADL调控宿主细胞MDBK的细胞自噬和凋亡通路及自噬改变对BVDV NADL复制影响的分子机制,并探索利用反向遗传学技术构建定点突变性BVDV毒株。(1)探索BVDV NADL影响MDBK细胞自噬的分子机制;(2)探讨MDBK细胞自噬水平改变后对BVDV复制的影响;(3)探究miR-29b对BVDV NADL感染诱导的细胞自噬及BVDV NADL复制的影响;(4)分析miR-29b对MDBK细胞凋亡的影响;(5)使用反向遗传学技术拯救定点突变型BVDV毒株。通过本研究的开展,为系统阐述BVDV持续性感染的分子机制、开发防控BVDV的新方法和家畜的抗病育种工作奠定理论依据。方法:(1)BVDV NADL感染GFP-LC3质粒转染的MDBK细胞,在处理后不同时间,采用实时定量PCR、Western blot、激光共聚焦显微镜和透射电镜等方法检测细胞自噬相关蛋白表达水平和自噬活性变化;并构建红色荧光标记的BVDV NADL三个糖蛋白Erns、E1和E2基因过表达的慢病毒,使用相同方法检测糖蛋白过表达对细胞自噬活性的影响;(2)使用自噬抑制剂、促进剂和RNA干扰技术分别处理MDBK细胞,检测细胞自噬水平的变化;并使用BVDV NADL感染自噬活性改变的MDBK细胞,检测BVDV NADL mRNA水平变化;(3)预测并鉴定miR-29b在自噬信号通路中靶基因ATG14和ATG9A;检测pre-miR-29b过表达的慢病毒和BVDV NADL感染后靶蛋白表达水平、细胞自噬水平及BVDV NADL复制水平;并设计ATG14和ATG9A回补实验,进一步验证miR-29b通过下调靶蛋白ATG14和ATG9A的表达,进而影响BVDV NADL感染诱导的细胞自噬水平和BVDV的复制;(4)预测和鉴定miR-29b在凋亡信号通路中的靶基因NAIF1和caspase-7;检测miR-29b模拟物和抑制剂转染后MDBK细胞凋亡水平及caspase-7和NAIF1 mRNA和蛋白表达水平;并设计caspase-7和NAIF1回补实验,进一步证明miR-29b通过下调caspase-7和NAIF1的表达,进而影响凋亡水平;(5)构建T7 RNA聚合酶基因过表达的慢病毒,并感染MDBK细胞;使用嘌呤霉素进行稳定表达筛选;检测T7RNAP表达水平和T7 RNA聚合酶活性;传至40代,鉴定MDBK-T7RNAP细胞的稳定性;并以pACNR/NADL质粒为模板,使用定点突变试剂盒突变E2和NS4B基因位点;转染突变质粒至MDBK-T7RNAP细胞中,拯救定点突变株,并检测BVDV定点突变株复制水平的变化;并传代鉴定其遗传稳定性。结果:(1)BVDV NADL感染及Erns和E2过表达都能显著性增加自噬体/自噬溶酶体的数量、GFP-LC3 puncta数量、Beclin1和ATG14 mRNA和蛋白水平;(2)3-MA、渥曼青霉素和RNA干扰能抑制细胞自噬活性和BVDV NADL的复制;相反地,rapamycin处理能显著性促进细胞自噬和增加BVDV NADL复制;当BVDV NADL感染18 h后,5’UTR转录水平出现降低,加入溶酶体抑制剂氯喹,其转录水平又出现升高;(3)miR-29b能特异性靶向ATG14和ATG9A的3’UTR区并抑制其表达;同时miR-29b高表达能显著性降低BVDV NADL的复制水平及其感染诱导的细胞自噬;ATG14和ATG9A表达回复后,BVDV NADL复制水平和BVDV NADL感染诱导的细胞自噬水平又出现升高;(4)miR-29b降低了MDBK细胞凋亡水平;miR-29b能直接靶向NAIF1和caspase-7 3’UTR并抑制其表达;NAIF1和caspase-7过表达后显著性增加细胞凋亡水平;(5)成功筛选获得具有较强的T7 RNA聚合酶活性和较好稳定性的MDBK-T7RNAP细胞;并成功构建E2和NS4B突变的BVDV毒株BVDV E2M和NS4BM;与亲本株相比,BVDV E2M和NS4BM mRNA复制水能力和增殖能力有所下降。结论:(1)BVDV NADL感染及Erns和E2过表达能显著性增加细胞自噬的活性,首次阐明BVDV感染对自噬的影响及其分子机制;(2)细胞自噬水平下降后阻止了BVDV NADL复制;早期自噬水平上调后增加了BVDV NADL的复制;阐述了自噬改变对BVDV复制的影响,也进一步为阐明BVDV持续性感染的分子机制奠定理论依据;(3)miR-29b直接靶向自噬相关蛋白ATG14和ATG9A并抑制其表达,进而抑制BVDV NADL感染诱导的细胞自噬和BVDV NADL复制,阐明了miR-29b通过影响自噬进而影响BVDV复制的分子机制;(4)miR-29b直接靶向凋亡相关蛋白caspase-7和NAIF1并抑制其表达,进而降低MDBK细胞凋亡水平,阐明miR-29b影响细胞凋亡和BVDV复制的分子机制;(5)成功拯救生长能力有所降低和遗传稳定性好的BVDV点突变株E2M和NS4BM,为建立有效的BVDV定点突变型疫苗候选株提供了技术支持。