研究目的:　　 构建LRG47/EBP50和LRG47/EBP50-RFP基因共修饰的耻垢分枝杆菌治疗性载体疫苗,使之能靶向进入Mφ,以便于后续从分子和细胞水平研究其抗Mtb感染的效果和机制。有望克服潜伏感染、多重耐药和再燃等结核病治疗难题,为开辟一条结核病防治的新思路奠定理论基础。　　 研究策略与方法:　　 1.利用RT-PCR从小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞中扩增出EBP50基因、LRG47基因分别克隆至pCDNA3.1中,送去测序。测序正确后,通过次序严密的分步克隆,将EBP50基因片段亚克隆入双启动子真核共表达质粒pBudCE4.1的HindⅢ/BaMHⅠ位点中、将LRG47基因亚克隆入pBudCE4.1的KpnⅠ/XhoⅠ位点中、分枝杆菌复制子OriM基因亚克隆入pBudCE4.1的NheⅠ位点中,形成穿梭/共表达质粒pLEM并转染人293T细胞中进行表达鉴定。通过RT-PCR和Westernblot对目标基因产物进行检测。　　 2.利用PCR从pSIREN-DNA-DsRed-Express中扩增出RFP基因并克隆至pCDNA3.1的EcoRⅠ/XbaⅠ位点中,形成pCDNA3.1-RFP,利用PCR从pLEM中扩增出EBP50基因并克隆至pCDNA3.1的HindⅢ/EcoRⅠ位点,形成pCDNA3.1-EBP50②,测序正确后,将EBP50基因亚克隆至pCDNA3.1-RFP中。通过次序严密的分步克隆,将EBP50-RFP片段亚克隆入双启动子真核共表达质粒pBudCE4.1的HindⅢ/BaMHⅠ位点中、将LRG47基因亚克隆入pBudCE4.1的KpnⅠ/XhoⅠ位点中、分枝杆菌复制子OriM基因亚克隆入pBudCE4.1的MheⅠ位点中,形成穿梭/共表达质粒pERLO并转染人293T细胞中进行表达。通过RT-PCR、荧光显微镜直接观察和Westernblot对目标基因产物进行检测。　　 3.通过Westernblot检测耻垢分枝杆菌Ms1-2c对腹腔巨噬细胞(PDMs)内源性表达的EBP50、LRG47的影响。将pLEM、pERLO质粒电转化耻垢分枝杆菌Ms1-2c,鉴定无误后分别命名为rMS-pLEM、rMS-pERLO,扩增、洗涤后用于感染小鼠巨噬细胞RAW264.7和小鼠腹腔巨噬细胞(PDMs),观察其对巨噬细胞的靶向性。　　 实验结果:　　 1.成功构建了携带小鼠EBP50基因、小鼠LRG47基因、分枝杆菌复制子OriM基因的共表达质粒pLEM,转染入人293T细胞中后通过RT—PCR、Westernblot等方法从转录和翻译水平都检测到了目标基因的表达产物。　　 2.成功构建了携带小鼠EBP50-RFP表达基因、小鼠LRG47基因、分枝杆菌复制子OriM基因的共表达质粒pERLO,转染入人293T细胞中后通过RT—PCR、荧光观察和Westernblot方法均检测到了目标基因的表达产物。转染入小鼠RAW264.7中观察到红色荧光表达。　　 3.Ms1-2c能促进小鼠腹腔巨噬细胞内的EBP50、LRG47内源性表达。成功得到了靶向性良好的重组耻垢分枝杆菌rMS-pLEM、rMS-pERLO。　　 结论:　　 1.LRG47与EBP50能同时在真核细胞中表达出来。　　 2.EBP50与RFP能融合表达,便于后续动物实验中EBP50在巨噬细胞内的定位检测。　　 3.Ms1-2c能作为巨噬细胞的靶向性载体。　　 4.Ms1-2c能上调巨噬细胞内内源性的EBP50与LRG47的表达。