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肉毒毒素（Botulinum neurotoxin,BoNT）由肉毒梭菌（Clostridium botulinum）在厌氧条件下产生,是目前已知毒性最强的物质。人体的半数致死剂量LD50仅为0.1-1ng/kg。由于中毒剂量小,潜伏期短,致死率高,而又易于制备获得,因此肉毒毒素作为潜在的生物恐怖剂,成为近年来医学防护研究的热点领域。发生肉毒中毒后,如果能够及时诊断并采取正确手段治疗,可以有效降低死亡率,而快速、准确的毒素分析系统的建立对于肉毒毒素的防治研究具有重要的意义。目前,国内主要以国标GB4789.12-94作为肉毒中毒的实验室分析标准,分析的关键在于检出污染物中存在肉毒毒素并鉴定出毒素型别。同时,由于肉毒毒素作为潜在的生物恐怖剂,其危害已经不仅仅局限于传统的中毒途径如食品污染,而扩大到可能出现不同规模的恐怖袭击,因此,这对肉毒毒素的检测分析系统也提出了新的要求:灵敏度高;速度快;能一次性检出多种血清型（A-G）;能够定量分析毒素毒力;能够检测复杂样本;操作简便,易于推广使用,以应对突发事件。肉毒毒素通过特异识别切割底物从而最终发挥毒性,因此通过检测底物水解的情况,可以实现对待测样品中肉毒毒素的毒力进行分析的目的。本研究基于肉毒毒素对底物切割的型特异性和底物构象变化的特性,利用可识别底物酶解产物肽的特异抗体,拟建立A型肉毒毒素毒力分析系统。为了得到A、E型肉毒毒素底物SNAP-25,本研究根据Genbank中已报道的SNAP-25全基因序列设计特异引物,通过RT-PCR从小鼠全脑组织总RNA中得到基因,并通过基因克隆手段将全长基因克隆至原核表达载体pET22b中,重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞,IPTG诱导表达。将表达产物经Ni-NTA金属螯合层析法纯化后获得重组蛋白,浓度为1.552 mg/ml。通过免疫印迹对重组蛋白进行鉴定,并使用A型肉毒毒素对其活性进行初步鉴定,结果证明重组蛋白具有能被A型肉毒毒素特异切割的活性,为其进一步应用于A型肉毒毒素分析系统奠定了良好的基础。作为毒素毒力分析系统,在应用于未知样品分析的同时,为了尽可能的消除操作环境及人员等客观因素对结果产生的影响,确保结果真实可靠,相应的阳性对照样品的设置必不可少;同时,考虑到肉毒毒素的强毒性,其对于毒力分析系统建立过程中实验人员及未来的众多实际操作者存在一定潜在的危险性,需要找到一种具有肉毒毒素的内肽酶活性,同时对人不具备直接毒性的替代物。根据已有文献报道,A型肉毒毒素Lc片段（ALc）具有毒素的内肽酶活性,可以特异识别并切割其底物SNAP-25,但由于其缺乏能够通过与靶细胞受体结合作用将毒素分子内化到细胞膜内的毒素Hc片段（AHc）,因此对于生物个体并不具有毒性。以此为理论依据,本研究根据Genbank中已报道的ALc全基因序列设计特异引物,以肉毒梭菌为模板,通过PCR钓取基因。将ALc基因克隆至原核表达载体pET32a中,重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞,IPTG诱导表达。表达产物经Ni-NTA金属螯合层析法纯化,获得重组蛋白,浓度为3.010mg/ml。通过免疫印迹对其进行鉴定,结果显示重组蛋白具有对特异抗体的结合活性。将重组ALc与SNAP-25在适当的条件下共孵育,通过SDS-PAGE检测,结果显示重组底物SNAP-25蛋白能够被Alc切割,并呈浓度梯度效应。初步证明了重组ALc具备A型肉毒毒素的内肽酶活性,为其在A型肉毒毒素分析系统建立及使用过程中对毒素的替代提供了可行性。根据现有文献报道,A、E型肉毒毒素对其底物SNAP-25的切割具有高度特异性,其中,A型肉毒毒素切割位点为Q197-R198,E型肉毒毒素切割位点为R180-I181。而SNAP-25上切割位点所处的位置平时隐藏于三级结构的螺旋之中,经过毒素切割,才会因底物失去空间构象变为线性肽而暴露出来。毒素切割引起的底物构象变化为检测底物水解情况的分析方法的建立提供了理论依据。针对此变化,本研究人工合成A型肉毒毒素在SNAP-25上切割位点前端十个氨基酸残基长度的短肽subA-NKTRIDEANQ作为抗原,通过免疫来航蛋鸡,收集卵黄,使用硫酸铵沉淀法得到anti-subA IgY抗体,用于检测SNAP-25经毒素切割后切割位点附近部分氨基酸残基的构象变化。经过蛋白定量和效价测定,anti-subAIgY蛋白含量为35.51mg/ml,在1:32000时仍具有良好的结合活性。经实验验证,anti-subA IgY不能与完整的具有空间构象的SNAP-25结合,而只能与经过A型肉毒毒素切割后变为线性肽的SNAP-25片段subA结合,可以反映出样品中A型肉毒毒素的毒力情况。根据文献报道,肉毒毒素在不同的反应条件下其活性不同,同时,作为底物的SNAP-25及作为A型肉毒毒素替代物的ALc在不同溶液中活性也有不同。为了保证分析系统的效果,使其在保证足够灵敏度的同时,尽可能地使分析过程稳定、快速、经济,本研究使用系列浓度的ALc作为分析对象,以重组SNAP蛋白为检测底物,以anti-subA IgY为检测抗体,对在不同条件组合下的分析结果进行比较,进行条件优化选择。通过对SNAP-25和ALc各自所处的缓冲液进行优化,最终选取SNAP-25（Ni-NTA洗脱缓冲液）及ALc（PBS缓冲液）;通过组合反应温度（37℃、RT）和反应时间（1h、2h、4h）,最终选取37℃、1h;通过对底物包被量进行比较,最终选取每孔包被0.4μg SNAP-25。使用分析系统在最优反应条件下对A型肉毒毒素标准品进行分析,获得本分析系统的LOD为0.1 LD50（小鼠）/ml（相当于0.4 pg/ml）,LOQ为1.6 LD50（小鼠）/ml（相当于6.4 pg/ml）;将A型肉毒毒素标准品及ALc的分析结果进行相关性分析,进一步证明可以在分析系统的建立及使用过程中使用ALc做为A型肉毒毒素的替代物,从而能够实现对样品中一定范围内(BoNT/A为0.013-10.503 LD50/100μl)A型肉毒毒素的定量;使用E型肉毒毒素对分析系统的特异性进行验证,显示特异性良好;将A型肉毒毒素混入牛奶、人血清作为模拟样品对方法的精确性进行验证,结果显示在牛奶或人血清混合物中分析方法均具有良好的精确性（88%＜Recovery＜111%,inter-assay and intra-assayCV＜20%）。