论文部分内容阅读
铜是有机体生长所必需的元素,但在越来越多的农业生产和工业应用中铜已经成为环境污染的只要来源之一。过量的铜会诱导植物和绿藻产生过量的活性氧,进而影响植物和绿藻的生长与代谢；为了应对铜胁迫有机体会产生一些对抗机制,其中之一就是积累大量脯氨酸。尽管如此,铜胁迫下植物和绿藻的生理生化过程尚知之甚少。一氧化氮(NO)作为信号分子能够介导多种生物和非生物胁迫诱导的生理反应。本文研究了莱茵衣藻内铜诱导的NO的产生与脯氨酸合成之间的关系,结果显示,被测试藻暴露在低铜浓度下(2.5and5.0μM Cu2+)积累了大量的脯氨酸。同时还观察到随着供铜浓度的增加细胞内外NO的浓度也伴随着相应的增多。数据分析表明莱茵衣藻在铜胁迫下内源NO的产生与脯氨酸水平的变化成正相关。通过分别添加NO特殊供体SNP与NO捕获剂cPTIO确定NO参与脯氨酸的积累。铜处理的藻细胞经10μM SNP预处理后其脯氨酸的积累增加了1.5倍,同时添加10μM cPTIO能阻止这种影响。进一步研究铜和NO对脯氨酸合成中的关键酶△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS, EC2.7.2.11)活性与转录量的影响,发现铜处理的衣藻中SNP的应用能激发P5CS的活性并上游调控P5CS基因的表达,相反,cPTIO却能抑制这种现象。这些结果显示莱茵衣藻内铜胁迫响应的脯氨酸合成与NO的产生密切相关,进而表明NO在重金属铜胁迫下脯氨酸代谢中的调控作用。铁同样是植物和绿色藻类生长所必需的营养元素,但是由于外界Fe(Ⅲ)的不可利用性及植物和绿藻对铁吸收效率普遍不高,导致植物与绿藻经常出现缺铁症状,即萎黄症。因此怎样调控这一生理病症是个亟待解决的问题。CO是动物体内的内生性气体分子并调控一系列的生理生化进程,但是CO是否也调控植物与微藻体内的营养胁迫响应则研究甚少。本文研究了缺铁状态下莱茵衣藻细胞内CO对铁平衡的调控。发现8μM的外源性CO能够阻止缺铁引起的萎黄症并能提高细胞叶绿素的积累,使衣藻恢复绿色,并且衣藻叶绿体片层结构也在加入外源CO后清晰可见。而CO更能上游调控缺铁状态下衣藻细胞中FTR1, Fd, FOX1等与铁吸收转运相关的基因的表达。外源性CO还能够提高缺铁细胞的铁含量。胞内CO的产生与血红素氧化酶heme oxygenase1(HO-1, EC1.14.99.3)密切相关。血红素氧化酶能够催化血红素分解成CO,亚铁离子和胆绿素。研究表明缺铁诱导莱茵衣藻内HO-1基因的表达,说明内源CO可能参与莱茵衣藻缺铁响应过程。我们测定了缺铁状态下HO-1,FOX1等酶的活性,发现这些酶活性都被诱导提高。为了更深入地证明HO-1及CO缓解缺铁胁迫的作用,我们构建了莱茵衣藻HO-1过表达载体,和作为对比的HO-1敲除载体,并先后获得能够稳定遗传的转化子。对缺铁状态下的转基因衣藻进行一系列生理生化及分子功能鉴定后,发现HO-1过表达藻株能够完全抑制失绿现象,且包括HO-1在内的一些关键基因都能高效表达,酶活测定也显示HO-1与FOX1酶活力增加。透射电镜观察发现HO-1过表达藻体的叶绿体片层结构在铁缺乏情况下始终清晰可见,与正常藻细胞差别不大。而HO-1敲除转化子不能使藻细胞恢复绿色,叶绿素片层结构也不完整并遭到严重破坏。进一步研究发现,添加外源性CO后正常生长的莱茵衣藻在铁缺乏状态下细胞内的NO水平有所提高；同样的HO-1转基因衣藻在缺铁条件下其细胞内的NO水平也显著提高,这两种现象都能够通过添加NO捕获剂cPTIO得到逆转,说明CO的调控作用需要NO的参与并有可能受到NO的上游调控。本研究表明CO能够提高莱茵衣藻对缺铁的耐受性,并在缺铁状态下与NO交互调制一起调控铁的转运吸收。由以上结果得出结论：CO与NO能够作为信号分子调节莱茵衣藻在重金属胁迫下的响应。