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半纤维素资源是自然界中最丰富的可再生资源之一,将其通过微生物转化方法生产木糖醇是高值化利用的有效途径。本论文在实验室已有工作的基础上,利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,对E.coli W3110进行代谢工程改造,强化其辅酶NADPH的再生,构建一株多拷贝整合木糖还原酶高产木糖醇的菌株。本工作采用双质粒CRISPR系统,通过构建不同pTargetF质粒和修复模板,使用木糖还原酶基因表达模块替换ptsG、ptsF和xylAB基因,获得一株整合了 3个木糖还原酶基因拷贝数的出发菌株WZ04。并在此基础上,分析大肠杆菌的葡萄糖代谢通路,通过实验分别敲除EMP途径中编码磷酸果糖激酶的pfkA、pfkB基因及磷酸葡萄糖异构酶的pgi基因和转氢酶sthA基因,获得相应的工程菌并检测胞内NADPH/NADP+的比值和发酵液中的木糖醇含量,获得了最优改造后的菌株WZ41。该菌株胞内辅酶NADPH/NADP+比值为出发菌株的1.68倍,有效地提高了木糖醇对葡萄糖的得率;通过RT-qPCR、菌株的生长性能及摇瓶发酵生产木糖醇的能力综合分析得出木糖还原酶表达模块的整合拷贝数最佳为5,使用该菌株进行摇瓶发酵,补加混糖后30h,发酵液中木糖醇浓度为16.76g/L,葡萄糖和木糖残余量分别为0.44 g/L和10.50 g/L。最后,我们将辅酶改造的策略应用在原有构建的高产菌株IS5-d中,得到最优改造菌株IS5-d △pfkA,该菌株在摇瓶发酵中,与未改造的IS5-d菌株具有相同的生长速率,且发酵结束后木糖全部转化为木糖醇,无葡萄糖和木糖残留。使用该菌株进行发酵罐放大,以工业级玉米浆干粉为氮源,葡萄糖母液为碳源,半纤维素水解液为补料液进行分批补料发酵,木糖醇的终浓度达126.62g/L,木糖和葡萄糖等糖类全部消耗,生产效率达2.01g/L/h。