第一章 AngⅡ对体外培养的乳鼠心肌细胞炎性因子表达的影响及隐丹参酮的干预作用　　 目的：　　 心室重构是多种因素参与的复杂的病理生理过程，炎症反应与心室重构关系密切，对其产生的机制及干预研究有助于心室重构的转归。血管紧张素(AngⅡ)是肾素-血管紧张素系统(RAS)的主要效应因子，循环和组织的AngⅡ浓度增高，可促进心肌细胞肥大和间质纤维化，从而参与了心肌重构的病理过程。除作为重要的生长因子外，AngⅡ可以调节细胞因子、化学趋化因子和粘附分子等多种炎症介质的表达，作为炎症前期的调节物质参与机体炎症相关疾病的发生和发展。本实验通过AngⅡ诱导体外培养的乳鼠心肌细胞产生炎性反应并观察隐丹参酮的干预作用。　　 方法：　　 AngⅡ刺激体外培养的新生SD大鼠心肌细胞，采用倒置荧光显微镜检测DHE荧光强度等方法反映细胞内氧化应激状态。　　 应用免疫荧光法检测NF-κB核转位活化情况，酶联免疫法(ELISA)检测细胞上清中TNF-α、IL-6的表达水平。　　 结果：　　 1.使用倒置荧光显微镜在正常情况下可以检测到细胞内的少量红色荧光，100nMAngⅡ作用于细胞后，荧光明显增强，2.5，5μM及10μM CTS预处理剂量依赖性抑制了AngⅡ的作用，10μM CTS组使荧光强度恢复接近正常水平。　　 2、100nM AngⅡ及100ng/ml LPS作用于心肌细胞30min后NF-κB明显入核，2.5、10μMCTS预处理剂量依赖性的抑制了AngⅡ的作用。　　 3、100nM AngⅡ作用24后，细胞上清中TNF-α、IL-6显著增加，2.5、5、10μM CTS预处理剂量依赖性的抑制了AngⅡ的作用。　　 结论：　　 1、AngⅡ可诱导心肌细胞氧化应激反应，隐丹参酮可减轻AngⅡ的作用。　　 2、AngⅡ可诱导心肌细胞产生炎性反应，包括促进NF-κB入核，促进炎性因子TNF-α、IL-6产生；　　 3、隐丹参酮剂量依赖性抑制AngⅡ促进NF-κB入核及促进炎性因子TNF-α、IL-6产生的作用。　　 第二章 TLR4在AngⅡ诱导的心肌炎性反应中的作用　　 目的：　　 Toll样受体4(TLR4)是近期发现的Ⅰ型跨膜受体，可介导多种病原体的识别和免疫活化过程，从而表达炎症细胞因子和化学因子，但TLR4是否可以介导AngⅡ引起的心肌炎性反应尚不清楚。因此，本章观察了TLR4在AngⅡ诱导大鼠心肌细胞炎性反应中的作用。　　 方法：　　 采用RT-PCR和Western blot方法观察了AngⅡ诱导TLR4表达的时效和量效关系；采用抗体阻断及RNA干扰(RNAi)方法，观察沉默TLR4基因后对AngⅡ诱导心肌细胞产生TNF-α、IL-6的影响，探讨TLR4与下游炎症因子基因之间是否存在相关关系。　　 结果：　　 1、AngⅡ上调心肌细胞TLR4 mRNA和蛋白表达具有剂量依赖性，在时效关系上，100nM AngⅡ作用1h后TLR4 mRNA即显著升高(与对照组比较，P＜0.01)，12h-24h维持高峰水平。100nM AngⅡ作用6h后TLR4蛋白显著升高(与对照组比较，P＜0.01)，12-36h维持高峰水平，48h后表达逐渐下降。　　 2、抗TLR4抗体(1ug/ml，5ug/ml)可以剂量依赖的抑制AngⅡ诱导的TNF-α、IL-6分泌升高。　　 3、三对Stealth siRNA都有抑制细胞TLR4的蛋白基础表达及AngⅡ诱导的TLR4蛋白表达的效果，其中stealth(S1)的抑制作用最强。　　 4、TLR4基因沉默显著抑制了AngⅡ诱导的TNF-α、IL-6分泌，100nM AngⅡ作用于心肌细胞24h后，TNF-α、IL-6水平分别增加约至对照组的3.1倍(p＜0.01)和3.3倍(p＜0.01)，S1转染组使AngⅡ的效果分别降至对照组的1.5倍和1.7倍，与AngⅡ组相比具有统计学差异；而阴性对照序列则没有影响。　　 结论：　　 1、AngⅡ诱导TLR4表达具有随时间和剂量变化的趋势。　　 2、三对干扰序列中，stealth(S1)是最有效的抑制TLR4基础表达的序列。　　 3、TLR4在AngⅡ诱导的TNF-α、IL-6分泌中有重要作用。　　 第三章 AngⅡ诱导心肌细胞TLR4表达的信号通路及分子机制　　 目的：　　 参与血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导TLR4表达的信号通路与相关的转录因子目前仍不太清楚。本研究探讨AngⅡ诱导TLR4表达的分子机制，为寻找炎症相关疾病的分子靶标提供理论依据。　　 方法：　　 通过Western blot方法检测ERK1/2磷酸化信号通路在AngⅡ作用下的激活；用RT-PCR和Western blot方法观察了AT1 R的特异性阻断剂Valsartan、ERK1/2上游激酶MEK1/2的特异性阻断剂U0126、NAD(P)H氧化酶的抑制剂DPI及隐丹参酮预处理细胞后AngⅡ对TLR4表达的影响。瞬时转染和缺失分析寻找TLR4启动子区潜在的AngⅡ效应元件；凝胶电泳迁移率变动分析(EMSA)证实转录因子与启动子的特异性结合以及U0126对此作用的影响。　　 结果：　　 1、AngⅡ可以增加心肌细胞ERK1/2的磷酸化程度。　　 2、100nM AngⅡ作用24h后，TLR4的mRNA和蛋白表达水平明显升高，而Valsartan、U0126和DPI预处理则可以减弱AngⅡ的作用(mRNA：Valsartan，-61％，P＜0.01；U0126，-49％，P＜0.01，DPI，-40％，P＜0.05；protein：Valsartan，-75％，P＜0.001；U0126，-42％，P＜0.01，DPI，-50％，P＜0.01)。　　 3、TLR4启动子-190～-52序列内存在潜在的AngⅡ效应元件。　　 4、TLR4启动子-146及-120位置分别存在转录因子AP-1和Ets的结合域；AngⅡ可以增加AP-1及Ets和DNA的结合活性，该作用被U0126部分拮抗。　　 结论：　　 1.AngⅡ作用于AT1R，通过ROS及ERK1/2信号途径使TLR4表达上调。　　 2.AngⅡ通过激活ERK1/2，增加AP-1及Ets与TLR4启动子的结合，使TLR4表达上调。