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酒精性肝病(Alcoholic liver disease,ALD)是由于长期大量饮酒导致的肝脏疾病。初期通常表现为脂肪肝,进而可发展成酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化。其分子机制和病理机制不明,临床上没有确切的药物用于ALD。研究发现嘌呤能信号(Purinergic signalling)参与肝脏疾病的病理生理调节过程。乙醇等外界刺激下,细胞将胞内三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate,ATP)释放至胞外,提示机体启动免疫防御。当细胞应激或受损时ATP释放至细胞外,立即被胞外酶CD39(ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase,NTPDase1)水解为一磷酸腺苷(Adenosine Monophosphate,AMP),而胞外CD73(Ecto-5’-Nucleotidase,NT5E)将AMP水解为腺苷(Adenosine)。腺苷脱氨酶(Adenosine Deaminase,ADA)可水解灭活腺苷。因此,胞外酶CD39-CD73共同调控腺苷浓度。肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSCs)也表达CD39和CD73,但是到目前为止还没有相关文献对其在ALD炎症和纤维化中的作用进行系统的报道。本课题组前期研究发现HSCs的腺苷受体(Adenosine Receptors,ARs)在乙醛(Acetaldehyde,Ace)作用下激活后通过c AMP-PKA(Proteinkinase A)-CREB(c AMP-Response Element Binding Protein)信号通路促进HSCs活化增殖。此外,ARs拮抗剂及Caffeine可减轻酒精性肝纤维化中HSCs活化增殖。进一步证实腺苷信号通路调控ALD纤维化。研究目的:本项研究中,按照课题组前期发表的文献分别复制急性酒精性肝损伤小鼠模型和细胞模型,慢性酒精性肝纤维化小鼠模型和细胞模型,研究ATP-CD39-CD73信号通路调控HSCs炎症因子和纤维化因子分泌在急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化过程中的作用。研究方法:(1)参考本课题组以前发表文章中的方法,分别建立急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化小鼠模型。提取HSCs,参考本课题组以前发表文章中的方法分别建立急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化细胞模型。(2)计算平均体重和肝比重,全自动生化分析仪检测动物血清生化指标和纤维化指标,取肝组织做病理切片,分别做Hematoxylin-Eosin(HE)染色、Masson三基色染色、Van Gieson(VG)染色和天狼星红(Sirius red)染色,免疫组化法分析肝组织α-Smooth Muscle Actin(α-SMA)蛋白表达,荧光免疫双染检测肝组织CD39和CD73表达,HE染色POM-1高中低三个剂量组的肝组织病理切片。阐明CD39和CD73可能在急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化动物模型中发挥重要作用。(3)Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction(RTq PCR)法检测CD39,CD73,炎症因子和纤维化因子的基因表达。Western blotting法检测CD39、CD73、炎症因子和纤维化因子的蛋白表达,生物发光法检测ATP浓度和高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)法检测腺苷含量。阐明CD39和CD73可能在急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化细胞模型中发挥重要作用。(4)分别建立急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化HSC模型,检测CD39和CD73的激动剂和拮抗剂对细胞模型炎症因子和纤维化因子蛋白表达的影响,同时检测HSCs培养上清液中ATP和腺苷含量变化。阐明ATP-CD39-CD73信号通路在急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化细胞模型中的作用。(5)使用小干扰RNA/沉默RNA(Small interfering RNA/silencing RNA,si RNA)分别沉默CD39基因和CD73基因,检测基因沉默后对急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化HSC模型的影响。阐明CD39和CD73沉默在急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化细胞模型中发挥作用。SPSS(Statistical Product and Service Solutions)17.0软件统计数据,Graphpad prism 8.0软件做图。结果:(1)急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化动物实验中两个模型组的平均体重、肝比重、血清生化指标、血清肝纤四项指标、肝组织病理、免疫组化、荧光免疫双染结果均较对照组有明显变化,HE染色结果显示POM-1大剂量可减轻急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化,荧光免疫双染结果发现急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化模型组小鼠肝组织CD39和CD73表达增加。提示急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化动物模型建立成功。(2)在体外实验中,模型组胞外酶CD39和CD73、炎性细胞因子和成纤维细胞因子的表达均明显增加,提示CD39和CD73可能在急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化过程中发挥调控作用。(3)体外实验中,CD39拮抗剂ARL67156和CD73拮抗剂APCP可以显著降低CD39和CD73蛋白的表达,二者均可以降低炎性细胞因子和成纤维细胞因子的蛋白表达,同时,细胞培养上清液中ATP和腺苷的浓度也发生了相应的变化。提示ATP-CD39-CD73信号通路在急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化细胞模型中发挥调控作用。(4)CD39 si RNA和CD73 si RNA可分别降低急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化细胞模型中CD39和CD73的蛋白表达,二者均可降低细胞模型炎症因子和纤维化因子的蛋白表达,细胞培养上清液中ATP和腺苷浓度也有相应的变化。提示ATP-CD39-CD73信号通路在急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化细胞模型中发挥调控作用。结论:(1)ATP-CD39-CD73信号通路在急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化过程中发挥作用。(2)抑制或沉默CD39可以减轻急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化。(3)抑制或沉默CD73可以减轻急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化。