第一章绪论　　临床上前列腺癌经内分泌治疗18～36个月后，通常会变成激素非依赖性前列腺癌。其转变的机制十分复杂，曾有克隆选择学说、癌细胞适应学说、信号传导途径改变学说、雄激素受体(AR)变异学说等多种推测。目前AR及其所介导的信号传导通路逐渐成为该领域的主要研究方向，并取得了许多重要的进展。Her-2/neu基因是原癌基因，通常处于非激活状态。近年来的研究发现Her-2/neu在乳腺癌、卵巢癌、大肠癌、前列腺癌及肺癌等恶性肿瘤的发生、发展、治疗及预后中起着不同程度的作用。例如Her-2/neu在20～30％的人乳腺癌中存在过表达，针对Her-2/neu蛋白的单抗已证明在Her-2/neu蛋白过表达的乳腺癌中有很明显的治疗作用。在前列腺癌的研究中发现Her-2/neu蛋白过表达可通过交叉激活(transactivation) AR、不依赖雄激素的存在而激活AR的转录，引起前列腺癌发生及发展，可能与激素非依赖性前列腺癌的转变有关，这引起了研究者们的高度兴趣。本研究课题在前列腺癌患者标本中检测Her-2/neu蛋白的表达情况，进一步明确Her-2/neu蛋白在前列腺癌组织中的表达及其与患者临床病理特征的关系;采用RNA干扰(RNAi)技术观察沉默前列腺癌PC-3M细胞中Her-2/neu基因，降低Her-2/neu蛋白的表达对前列腺癌细胞是否有明显的抑制生长或增加凋亡的作用;本研究课题还采用RNAi技术尝试治疗前列腺癌荷瘤裸鼠，详细观察其有无治疗前列腺癌移植瘤的效果，探讨Her-2/neu在前列腺癌细胞中表达的意义及其作为靶点治疗前列腺癌的可能性，希望能为今后临床应用针对Her-2/neu的前列腺癌靶向治疗提供理论依据及实验研究结果。　　本论文正文分五个部分，下面分别陈述。　　第二章Her-2/neu蛋白及雄激素受体在前列腺癌组织中的表达　　目的：　　检测Her-2/neu蛋白和雄激素受体(androgen receptor, AR)在前列腺癌组织中的表达情况，探讨其在前列腺癌发生发展中的意义。　　方法：　　应用组织芯片技术和免疫组织化学方法检测107例前列腺癌及42例良性前列腺组织中Her-2/neu蛋白和AR的表达情况，并分析其与前列腺癌Gleason评分之间的关系。根据Gleason评分将前列腺癌标本分成4组:Gleason6分组，7分组，8分组及9分组。　　结果：　　Her-2/neu蛋白在前列腺癌组织中的阳性表达率（61/107例，57％）与在良性前列腺组织中的阳性表达率（12/42例，29％）相比有显著差异(p=0.002)。在不同的Gleason评分组中Her-2/neu蛋白阳性表达率无显著统计学差异（6分组中14/29例，48％;7分组中9/20例，45％;8分组中32/46例，70％;9分组中6/12例，50％），与Gleason评分无显著相关性。AR在前列腺癌组织中的阳性表达率（73/107例，68％）与在良性前列腺组织中的阳性表达率（23/42例，55％）相比无显著差异。在不同的Gleason评分组中AR阳性表达率无显著统计学差异（6分组中21/29例，72％;7分组中17/20例，85％;8分组中28/46例，61％;9分组中7/12例，58％），与Gleason评分无显著相关性。前列腺癌组织中Her-2/neu蛋白和AR的表达亦无显著相关性。　　结论：　　1、Her-2/neu蛋白在前列腺癌中的高表达提示其可能在前列腺癌发生中起一定作用。　　2、Her-2/neu蛋白在前列腺癌中的阳性表达与AR的表达、Gleason评分均无明显相关性。　　第三章Her-2/neu siRNA表达质粒的构建、鉴定及转染　　目的：　　构建靶向人Her-2/neu基因的siRNA重组质粒表达载体，将质粒转染入人前列腺癌细胞株PC-3M细胞中，为探讨Her-2/neu基因在前列腺癌发生发展中的作用提供工具。　　方法：　　根据基因库内人Her-2/neu基因(NM_001005862)序列及siRNA设计原则，获得3个RNAi靶位点后设计出对应的siRNA寡核苷酸模板，体外合成寡核苷酸片段经退火形成短双链，克隆到带有氨苄青霉素抗性、绿色荧光蛋白(GFP，用以追踪转染情况)的真核表达质粒载体pRNAT-U6.3/Hygro中U6启动子的下游，构建Her-2/neu siRNA重组质粒表达载体，同时设立随机序列阴性对照，对重组质粒进行酶切和DNA测序鉴定。利用转染试剂FuGene HD作为质粒转染载体，将构建好的质粒转染入人前列腺癌PC-3M细胞中。　　结果：　　1、限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ酶切显示质粒片段在7000～8000bp，符合所选择的载体pRNAT-U6.3/Hygro的大小。　　2、DNA测序显示设计合成的siRNA编码序列被成功插入pRNAT-U6.3/Hygro质粒中，证实插入片段与设计序列完全一致，无碱基突变。　　3、Her-2/neu siRNA表达质粒转染PC-3M细胞后可见明显绿色荧光(GFP)。　　结论：　　本实验成功构建并鉴定了针对人Her-2/neu的siRNA重组质粒表达载体;在荧光显微镜下观察到细胞内的GFP提示成功地将质粒转染入人前列腺癌细胞株PC-3M细胞中。　　第四章 Her-2/neu siRNA表达质粒对前列腺癌PC-3M细胞的作用　　目的：　　观察Her-2/neu siRNA表达质粒转染前列腺癌PC-3M细胞后，对PC-3M细胞中Her-2/neu表达及PC-3M细胞生物学行为的影响，并筛选出干扰效果最佳的干扰质粒进行下一步的动物实验。　　方法：　　采用免疫组织化学方法（EnVision两步法）检测前列腺癌细胞株PC-3M细胞的Her-2/neu蛋白表达情况。利用转染试剂FuGene HD将Her-2/neu siRNA表达质粒转染入人前列腺癌PC-3M细胞中，实时定量荧光PCR测定细胞中Her-2/neu mRNA的表达情况，Western blotting检测细胞中Her-2/neu蛋白水平的变化，流式细胞技术(FCM)检测细胞的凋亡情况，Cell Counting Kit-8(CCK)法检测细胞的生长抑制率。　　结果：　　免疫组织化学染色发现前列腺癌PC-3M细胞Her-2/neu蛋白呈强阳性表达。转染Her-2/neu siRNA表达质粒后，实时定量荧光PCR检测PC-3M细胞中的Her-2/neumRNA，发现其表达受到抑制，最高抑制率达69.8％; Western blotting检测发现PC-3M细胞中Her-2/neu蛋白的表达水平下降;流式细胞仪检测发现PC-3M细胞凋亡增加，凋亡率最高达39.55％; CCK8法检测发现PC-3M细胞生长受到抑制，生长抑制率最高达54.26％。构建的Her-2/neu siRNA表达质粒中编号为psiHer-2/neu-3的干扰质粒干扰效果最佳，可用于下一步动物实验。　　结论：　　1、免疫组织化学染色发现前列腺癌PC-3M细胞Her-2/neu蛋白呈强阳性表达。　　2、Her-2/neu siRNA表达质粒能有效抑制PC-3M细胞中Her-2/neu的表达，并抑制细胞的生长，增加细胞的凋亡。　　第五章裸鼠前列腺癌PC-3M细胞移植瘤模型的建立及肿瘤细胞中Her-2/neu蛋白的检测　　目的：　　确定建立前列腺癌PC-3M细胞裸鼠移植瘤模型所需的实验条件，检测肿瘤细胞的Her-2/neu蛋白表达情况。　　方法：　　将前列腺癌PC-3M细胞悬液100μl接种于5只雄性裸鼠颈背部皮下，接种细胞数为0.5×106个细胞/只（2只）、1×106个细胞/只（2只）及2×106个细胞/只（1只），观察成瘤情况。成瘤后切除肿块作病理HE染色及Her-2/neu免疫组织化学染色。　　结果：　　细胞接种后第17天接种细胞数0.5×106个细胞/只裸鼠50％（1/2只）、接种细胞数1×106个细胞/只裸鼠100％（2/2只）及接种细胞数2×106个细胞/只裸鼠100％(1/1)可触及皮下肿块，最大径1～3mm;23天后所有裸鼠均成瘤，最大径2～6mm。裸鼠接种PC-3M细胞后成瘤率高，达到100％（5/5只）。其中接种细胞数为1×106个细胞/只裸鼠及2×106个细胞/只裸鼠者成瘤快，适合下一步的实验。考虑到细胞培养工作量，选择接种细胞数为1×106个细胞/只裸鼠进行体内实验。　　病理检查示肿瘤细胞弥漫分布，似肉瘤样或低分化癌样改变，可见肿瘤性坏死，并浸润裸鼠皮下脂肪组织及横纹肌组织;高倍镜下肿瘤细胞呈梭形，胞浆丰富，红染，核大，圆或卵圆形，染色质粗，核膜清楚，核仁易见，核浆比例增大，核分裂像易见。　　肿瘤细胞Her-2/neu蛋白免疫组织化学染色为阳性，低倍镜下可见弥漫性棕黄色颗粒;高倍镜下细胞浆及胞膜上均见到棕黄色颗粒。　　结论：　　1、该方法建立的裸鼠前列腺癌动物模型成瘤率高，时间短，为下一步动物实验研究提供了条件。　　2、人前列腺癌PC-3M细胞裸鼠移植瘤免疫组化染色示Her-2/neu蛋白呈强阳性表达;该模型为以Her-2/neu为靶的前列腺癌治疗提供了较好的动物模型。　　3、选择接种细胞数为1×106个细胞/只裸鼠作为下一步动物实验的条件。　　第六章Her-2/neu siRNA表达质粒对前列腺癌动物模型的作用　　目的：　　在动物实验水平观察Her-2/neu siRNA表达质粒对前列腺癌裸鼠移植瘤生长的作用。　　方法：　　裸鼠皮下接种人前列腺癌PC-3M细胞，将荷瘤裸鼠40只随机分为4组:干扰质粒组(psiHer-2/neu-3质粒组，10只)，阴性质粒组（psiHer-2/neu-sc质粒组，10只）、转染试剂组（FuGene HD组，10只）及空白对照组（生理盐水组，10只）。所有荷瘤裸鼠每周给药一次，首次给药4周后处死动物，计算肿瘤大小及重量的变化;流式细胞仪检测肿瘤细胞周期变化及细胞凋亡情况;免疫组化方法检测肿瘤组织中核增殖抗原(Ki67)的变化。切取裸鼠肺、肝及腰椎行HE染色以观察有无肿瘤转移。　　结果：　　实验干预后，结果表明干扰质粒组裸鼠移植瘤的体积及重量均明显低于空白对照组、转染试剂组及阴性质粒组(p＜0.05)，但肿瘤表面皮肤破溃各组间无显著差异(p＞0.05);流式细胞仪检测肿瘤细胞增殖指数(32.46％)与转染试剂组(54.05％)相比明显下降(p=0.005)，与空白对照组(48.27％，p=0.056)及阴性质粒组(46.78％，p=0.057)相比无显著差异，但从数值上看，干扰质粒组细胞增殖指数降低。干扰质粒组凋亡指数(19.15％)与空白对照组(0.16％)、转染试剂组(0.14％)及阴性质粒组(0.04％)相比显著升高(p=0.01)。干扰质粒组肿瘤组织中Ki67阳性的细胞数明显少于空白对照组、转染试剂组及阴性质粒组(p=0.001)。各组裸鼠肺、肝及腰椎HE染色均未发现肿瘤转移。　　结论：　　通过RNAi技术抑制Her-2/neu的表达，在裸鼠体内可显著增加前列腺癌PC-3M细胞移植瘤细胞的凋亡，降低移植瘤细胞的核增殖抗原Ki67的表达，肿瘤的生长受到抑制。　　研究结论：　　1、前列腺癌组织中Her-2/neu蛋白阳性表达率明显高于良性前列腺组织，Her-2/neu蛋白在前列腺癌组织中的阳性表达与AR的表达及Gleason评分均无明显相关性。　　2、免疫组织化学染色示人前列腺癌PC-3M细胞及裸鼠PC-3M细胞移植瘤Her-2/neu蛋白呈强阳性表达。　　3、Her-2/neu siRNA表达质粒可降低人前列腺癌PC-3M细胞中Her-2/neu mRNA及Her-2/neu蛋白的表达，增加PC-3M细胞的凋亡，抑制PC-3M细胞的增殖。　　4、动物实验表明Her-2/neu siRNA表达质粒可显著增加前列腺癌PC-3M细胞移植瘤的凋亡，降低移植瘤的核增殖抗原Ki67的表达，肿瘤的生长受到抑制。