论文部分内容阅读
Akkermansia muciniphila是一种普遍存在于哺乳动物肠道中的黏液降解菌,已被报道在改善代谢疾病、调节肠道功能等方面具有重要的益生特性,被认为是潜在的“下一代益生菌”。大量研究表明A.muciniphila菌发挥益生功能的关键生理机制之一是基于其对宿主肠道屏障的调节,抑制肠道菌产生的内毒素进入血液,进而达到缓解机体慢性炎症的作用。目前针对A.muciniphila菌的研究主要集中于模式株ATCC BAA-835,但已有少量报道表明不同A.muciniphila菌株的益生功能存在显著差异。过往研究表明益生菌生理功能的差异性可能与菌株特有的功能基因及表面物质、代谢产物相关。因此,本课题拟探究A.muciniphila菌调节肠道屏障功能的菌株差异性特征,分析不同菌株影响肠道屏障的作用模式差异,比较菌株基因组上的差异功能基因,并进一步解析菌株调节肠道屏障的具体物质基础。主要研究结果如下:首先从实验室分离得到的A.muciniphila菌库中随机挑选6株具有不同基因组特征的菌株,通过建立葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的肠道屏障破坏小鼠模型对各菌株进行功能评价。结果表明A.muciniphila菌的肠道屏障调节功能具有菌株差异性,相比于造模组小鼠,喂食A.muciniphila JL50可显著改善小鼠的生理状况,同时降低肠道通透性并增加结肠紧密连接蛋白的表达,恢复DSS暴露导致的结肠组织病理损伤。另一A.muciniphila菌株GD49不仅不具备上述改善作用,甚至下调了结肠中ZO-1和Occludin等紧密连接蛋白的m RNA水平。此外,构建基于Transwell技术的体外肠细胞单层膜模型,同样证明了不同菌株调节肠道屏障的菌株特异性趋势,其中A.muciniphila JL50对跨上皮电阻的恢复程度可接近95%,而其余菌株恢复程度则在0%-85%不等。基于上述结果,进一步分析了不同菌株调节肠道屏障的作用模式差异:通过CCK-8法评价了A.muciniphila对肠上皮细胞活性的影响,结果显示不同菌株均可以显著恢复受DSS影响的上皮细胞活性,并不存在菌株特异性。通过实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白免疫印迹技术分析了不同菌株对肠细胞间紧密连接蛋白的影响,证明A.muciniphila JL50可恢复ZO-1和Claudin-1的水平,而A.muciniphila GD49并未体现出同样显著的作用效果,这与动物模型和细胞模型中不同菌株对肠道屏障的调节作用趋势一致,表明A.muciniphila菌肠道屏障调节功能的菌株特异性可能与菌株对肠道紧密连接蛋白的调节能力差异相关。进一步设立了A.muciniphila活菌和死菌的对照实验,发现菌株活性并不显著影响其肠道屏障调节能力,表明菌株发挥作用可能依赖于其表面物质而非代谢产物。在此基础上,通过比较基因组技术分析了具有显著肠道屏障调节能力差异菌株（A.muciniphila JL50和A.muciniphila GD49）的基因组特征差异。首先基于蛋白质直系同源簇数据库比对了不同菌株的核心功能基因占比,发现A.muciniphila JL50和A.muciniphila GD49在碳水化合物的转运和代谢、氨基酸的转运和代谢以及无机离子的运输等核心功能上不存在显著差异。同时对两株A.muciniphila菌进行了基因组相似性计算,发现其平均核苷酸一致性为98.17%,属于同一种属且基因组相似度极高。另外,通过亚细胞定位预测分析菌株表面的差异基因,发现相比于阴性菌株A.muciniphila GD49,能够显著增强肠道屏障的A.muciniphila JL50具有包括COG0438、COG2244等在内的16个特殊基因,通过基因功能注释证明部分相关基因与菌体表面蛋白合成相关。基于比较基因组结果,从菌种库中选择得到一株同样具备上述差异功能基因的菌株A.muciniphila GS9,在动物模型和细胞模型中证明相比于阴性菌株A.muciniphila GD49,该菌株同样具备显著的肠道屏障调节能力,进一步验证了菌体表面蛋白合成相关基因在A.muciniphila菌株调节肠道屏障中的作用。通过蛋白酶处理去除A.muciniphila JL50和A.muciniphila GS9表面蛋白,其肠道屏障调节能力显著降低;进一步分离得到上述菌株的表面蛋白提取物,在细胞模型中验证了其对紧密连接蛋白的调节作用。综上所述,本课题利用动物和细胞模型发现A.muciniphila菌调节肠道屏障的作用具有菌株差异性,其原因可能与不同菌株对肠细胞紧密连接蛋白的调节作用差异相关。进一步通过比较基因组证明A.muciniphila菌调节肠道屏障能力与其表面蛋白合成相关功能基因有关,并利用菌株对照和表面蛋白去除/提取实验验证了比较基因组分析结果。本研究为下一代益生菌A.muciniphila菌的资源挖掘和功能解析提供了新的视角,同时为具有显著肠道屏障调节能力功能菌株的定向选育提供了相关的基因和蛋白靶标。