研究目的： 在本实验室已构建的工程菌rhOP-1/pBV221/E.coliDH5α的基础上，经发酵、纯化、复性获得高纯度的有活性的rhOP-1。本项工作旨在利用明胶海绵(国药准字H32024096)作为载体制备rhOP-1植入剂型，研究其植入体内异位成骨活性，并按照国家药品审评中心制定的治疗用生物制品非临床安全性技术评审一般原则的要求，模拟临床用药观察rhOP-1/明胶海绵植入剂的免疫原性、肌肉刺激性和毒性反应，对rhOP-1/明胶海绵植入剂进行安全性评价，为进一步临床应用提供实验依据。 研究方法： (1)发酵的rhOP-1工程菌经超声裂解法破裂，多次洗涤后收集包涵体，用含有8mol/L尿素的包涵体溶解液溶解目的蛋白，经SP-Sepharose和SephacrylS-100纯化后进行梯度透析复性。为进一步提高二聚体的纯度，复性后的rhOP-1用DEAFSepharose凝胶柱分离单体和二聚体。 (2)将吸收性明胶海绵加工成直径为5mm、厚度为2mm的圆片状，与透析复性的rhOP-1混匀后置于冷冻干燥机中冻干，使rhOP-1干粉充分吸附在明胶海绵载体上，制备rhOP-1/明胶海绵植入剂植入小鼠股部肌间隙。分别设立载体对照组和实验组，于2周、3周、4周时取材，对埋植样品进行钙含量检测和组织病理学检查，观察rhOP-1体内异位成骨活性。并把明胶海绵载体与不同剂量的rhOP-1复合，研究rhOP-1植入剂量与骨诱导活性的量效关系。 (3)考察以明胶海绵为载体的rhOP-1植入剂的免疫原性及肌肉刺激性。设空白对照组、阳性对照组和实验组，将样品植入小鼠股部肌间隙，于术后1周、2周、3周、4周时分别对6只小鼠眼球取血，分离血清，以间接ELISA方法检测血清中的免疫原性，并对取材样品做HE病理切片观察周围肌肉的形态变化。 (4)考察以明胶海绵为载体的rhOP-1植入剂的急性、长期毒性作用。设载体对照组和高、中、低三个剂量实验组，急性毒性实验观察两周，主要观察动物外观体征、行为活动、摄食量、排泄物的变化及动物的死亡情况。长期毒性实验在两周、四周取材时观察血液、血生化指标的改变，对主要脏器做HE病理切片观察组织形态改变，并计算脏器系数。 研究结果： (1)菌体经发酵诱导表达后，SDS-PAGE电泳显示目的蛋白约占菌体蛋白总量的35％，经SP-Sepharose和SephacrylS-100纯化后，rhOP-1单体纯度高达98％以上，纯化后的rhOP-1经梯度透析的方法复性，rhOP-1以单体和二聚体的形式存在。为提高rhOP-1二聚体的纯度，将复性后的rhOP-1用DEAE-Sepharose进一步分离，二聚体的含量由复性后的48％提高到97％以上。 (2)rhOP-1复合明胶海绵能体内异位诱导成骨，钙含量检测结果表明rhOP-1复合明胶海绵组高于单纯载体组。组织学观察到rhOP-1的骨诱导活性随着时间的延长，骨小梁、编织骨、骨髓腔的生成面积也逐渐增大，明胶海绵载体的缓释作用得以发挥。此外，钙含量和组织学检测结果均证实rhOP-1骨诱导活性随着植入剂量的增加而增强，rhOP-1植入剂量与其骨诱导活性正相关。 (3)间接ELISA结果表明此植入剂未引起小鼠的特异性抗体产生，植入部位肌肉虽出现炎细胞浸润现象，但随着时间的延长炎症反应逐渐减轻消散，未发现肌肉组织的坏死。 (4)急性毒性实验中未发现动物死亡，各组小鼠精神状况好，恢复较快，进食量、饮水量及排泄物未见明显差异。主要脏器的组织学检查镜下未见病理形态异常改变。长期毒性实验中，2周取材时血生化指标中除蛋白含量、谷丙转氨酶、谷草转氨酶实验组略低于对照组外，其余指标未见差异。4周时对照组和实验组在血液、血生化指标及组织学形态、脏器系数方面未发现差异，说明该植入剂体内没有明显毒、副作用。 结论： 在实验室已筛选的技术工艺基础上，建立了简便可行的rhOP-1/明胶海绵植入剂制备方法，并证实该植入剂具有体内骨诱导活性，通过研究其安全性说明该植入剂在免疫原性、肌肉刺激性和毒性方面安全可靠。