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实验目的:利用DNA免疫的方法制备抗人CD271分子单克隆抗体,探讨其是否可以成为用来鉴定、分选间充质干细胞的特异性的标志分子。实验方法:RT-PCR方法克降人CD271编码区全长基因,将扩增基因分别导入真核表达载体pcDNA3.1和原核表达载体pET22b中。(1)用基因免疫的方法,将重组质粒pcDNA3.1/CD271通过肌肉注射免疫BALB/C小鼠,并在每次DNA免疫前对小鼠股四头肌做如下预处理①DNA免疫前1周注射蛇毒心肌毒素②DNA免疫前15分钟注射25%的高渗蔗糖溶液。融合前3天脾内加强免疫一次,之后采用传统的淋巴细胞杂交瘤技术制备抗CD271分子单克隆抗体。每次免疫后7天通过流式细胞术检测小鼠血清中抗体分泌情况。应用夹心ELISA方法检测抗体的亚类,通过流式细胞仪(FACS)、荧光显微镜验证抗体与天然细胞膜蛋白的结合活性,Western blot验证抗体的特异性。(2)将扩增基因导入原核表达载体pET22b中,构建重组原核表达载体pET22b/CD271。实验结果:(1)扩增CD271全长基因1281bp,构建成pcDNA3.1/CD271重组质粒。(2)FACS检测血清滴度,3次DNA免疫后其最高为1:160,脾内加强免疫后滴度为1:320。(3)通过细胞融合、筛选和克隆化培养最后得到两株单克隆抗体487E和487D。(4)两株抗休亚类均为IgM,轻链均为K型。(5)免疫竞争实验表明487E和CD271(BD公司)识别不同的抗原表位。(6)FACS、免疫荧光显微镜和Western blot实验表明抗体与天然细胞膜蛋白和变性膜蛋白都有良好的结合活性和特异性。(7)成功构建原核表达载体pET22b/CD271。实验结论:针对CD271分子的单克隆抗体487E与骨髓和脐带来源的间充质干细胞均有良好的结合活性,从而为这两种来源间充质干细胞的大量有效分选和鉴定提供了可能。