沙门菌给养殖业和人类健康带来严重危害。目前除抗生素外,对于沙门菌病的防制尚无有效办法。疫苗,尤其是减毒活疫苗是一个研究方向。疫苗靶点选择也是沙门菌疫苗研究的核心。基于大肠菌素受体蛋白CirA在细菌生理上的重要作用,本研究以cirA基因为靶基因。利用λ-Red同源重组技术,构建了C50336ΔcirA,并对其生物学特性、LD₅₀和免疫特性进行了评价。具体实施如下:1.肠炎沙门菌rCirA蛋白免疫保护力分析设计针对性引物扩增cirA基因片段,并成功构建了重组质粒pEGX-6p-1-cirA,利用原核表达系统,表达的rCirA蛋白免疫小鼠,并对免疫小鼠血清进行抗体IgG检测;以C50336强毒株攻毒评估免疫效果。结果显示,经SDS-PAGE分析,在70 ku处出现目的蛋白条带并为沉淀表达;免疫小鼠抗体IgG水平持续上升;攻毒试验保护率仅为20%,表明rCirA蛋白对小鼠具有一定的免疫原型和保护力。2.肠炎沙门菌cirA基因缺失株的构建及生物学特性分析本研究利用λ-Red同源重组技术,构建了肠炎沙门菌cirA基因缺失株以及回补株。研究发现,cirA基因缺失株的生长速率和生化特性对亲本株影响不大;与亲本株相比,cirA基因缺失株的生物被膜形成能力、运动能力、感染Caco-2细胞黏附与侵袭能力与在巨噬细胞RAW264.7中存活率明显减弱;RT-PCR检测cirA基因缺失对肠炎沙门菌毒力因子的影响,数据支持了上述研究结果。表明CirA蛋白是一种参与肠炎沙门菌感染的多功能蛋白。3.肠炎沙门菌cirA基因缺失菌株的致病力及免疫特性分析以BALB/c小鼠为模型,与亲本株相比,C50336ΔcirA的LD₅₀大约提高了8000倍;以C50336菌株对C50336ΔcirA免疫2次的小鼠攻毒,结果显示,免疫组小鼠保护率为100%;病理切片结果显示,与C50336菌株攻毒小鼠相比,C50336菌株攻毒后的免疫小鼠,各脏器病变减轻;对免疫小鼠进行脾脏指数和血清抗体IgG水平测定,结果显示,免疫组小鼠脾脏指数与对照组相比差异显著,抗体IgG水平也持续上升。为进一步研发肠炎沙门菌的减毒活疫苗奠定了基础。