论文部分内容阅读
低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1alpha, HIF-1α)是转录因子-低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor, HIF-1)的氧调节亚基,是一种缺氧依赖性蛋白质,起着主要缺氧调节作用,决定HIF-1活性。HIF-1α在正常氧分压时很快被泛素依赖的蛋白水解酶水解,缺氧时在细胞内很快稳定并聚集,蛋白表达水平迅速增加,与HIF-1β结合构成异源二聚体,HIF-1大量表达,活性显著增高,进而启动涉及改善低氧条件的一系列基因表达,肿瘤细胞通过糖酵解速率提高和多血管体系形成,对低氧环境发生一系列适应性反应,在维持肿瘤细胞的能量代谢、新血管生成、促进肿瘤增殖和转移中起重要作用,同时增加了肿瘤对化放疗的抗拒性。RNA干扰(RNA interfering, RNAi)是一种转录后基因沉默(Post-transcriptional gene silence,PTGS)的基因阻断技术,近年来被广泛应用于哺乳动物细胞抑制基因表达。通过RNase III内切酶Dicer的作用产生有活性的小的21-23nt干扰性RNA(short interence RNA, siRNA),介导其互补同源mRNA序列的特异性降解,沉寂目的基因的表达。本课题采用RNAi技术,设计并合成针对HIF-1α基因的siRNA,转染胃腺癌细胞株BGC-823细胞,并进行裸鼠皮下移植瘤实验,检测HIF-1αmRNA水平和蛋白水平表达的变化;观察siRNA对胃癌细胞生长的影响并探讨对肿瘤血管生成的抑制作用,为胃癌的基因治疗奠定基础。第一部分RNA干扰抑制胃癌细胞中HIF-1α基因的体外实验目的:探讨RNA干扰对胃癌细胞株BGC-823HIF-1α转录和蛋白表达的影响以及对胃癌细胞增殖和凋亡的作用。方法:构建人HIF-1α基因的shRNA真核表达载体并转染BGC-823;采用RT-PCR和Western blot法检测HIF-1α的mRNA、蛋白表达水平;MTT法检测转染后对胃癌细胞的生长抑制率;流式细胞仪检测和原位末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡情况。结果:经酶切鉴定和测序分析,成功构建了pshRNA-HIF-1αl和pshRNA-HIF-1α2重组质粒;转染BGC-823后,与对照组相比,shRNA重组表达质粒可有效抑制BGC-823细胞HIF-1α基因转录和蛋白质表达,其抑制率分别可达93.4%和55.7%;MTT法显示转染后细胞生长抑制率明显高于对照组;流式细胞仪、TUNEL法结果表明转染后,其凋亡率明显高于对照组,BGC-823细胞增殖活性显著降低, G0-G1期细胞比例增加、S期与G2-M期细胞比例减少。结论:体外实验初步证实pshRNA-HIF-1αl能有效抑制胃癌细胞BGC-823 HIF-1α基因表达,抑制胃癌细胞增殖,诱导其凋亡,为进一步开展胃癌的基因治疗奠定了基础。第二部分HIF-1α特异的siRNA用于裸鼠皮下移植瘤的实验研究目的:探讨pshRNA-HIF-1α对胃癌BGC-823细胞裸鼠皮下移植瘤内HIF-1α表达的抑制作用,进一步研究pshRNA-HIF-1α在体内对肿瘤生长、血管生成的影响。方法:将胃癌细胞株BGC-823注射入裸鼠皮下,建立裸鼠皮下移植瘤模型。将pshRNA-HIF-1α导入移植瘤中,在体内诱导RNAi,观察肿瘤体积和重量的变化,免疫组织化学检测HIF-1α、血管内皮生长因子VEGF、肿瘤微血管密度(MVD)表达变化。结果:pshRNA-HIF-1α导入裸鼠皮下移植瘤后18d,与对照相比,肿瘤体积明显缩小,HIF-1α、VEGF表达明显下调,MVD值降低。结论:RNA干扰明显抑制了裸鼠皮下移植瘤的生长,对移植瘤中靶基因HIF-1α的表达、血管生成有明显抑制作用。