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土壤缺磷是限制小麦等农作物高产的主要因素之一。因此,揭示小麦调控缺磷响应的分子机制、探索提高小麦磷效率的分子育种途径具有重要的科学意义和应用价值。
PHR1是植物调控缺磷响应的关键基因,其功能在拟南芥和水稻中得到较好的研究,但对小麦PHR1(TαPHR1)如何调控缺磷响应以及利用TαPHR1改良植物磷效率的应用前景还未见报道。因此,本研究对小麦PHR1基因的序列结构、染色体定位、功能及有效利用进行了研究,以期为小麦磷高效利用的分子设计育种提供依据。主要结果如下:
通过筛选小偃54 BAC文库,从小麦中克隆了3个TαPHR1基因编码区的全长序列,分别命名为TαPHR1-A1、TαPHR1-B1和TαPHR1-D1。这3个基因分别被定位于7A染色体上7AS8-0.45至7AL1-0.39之间、4B染色体上的4BS4-0.37至4BL-0.71之间和4D染色体上4DL9-0.31-0.56之间。采用反向PCR技术克隆A、B、D组TαPHR1启动子序列,得到750 bp的TαPHR1-A1启动子序列,1562kb的TαPHR1-B1和1800bp的TαPHR1-D1启动子序列。启动子序列分析显示其上含有与光反应、干旱胁迫响应、糊分层发育、赤霉素响应和MYB结合等有关的大量调控元件,因此我们推测多种因素调控TαPHR1的表达。
利用Real-Time PCR定量分析了TαPHR1在小麦品种小偃54中的表达特性。在幼苗期,TαPHR1在地上部的表达量略高于根系中的表达量,且缺磷和正常供磷下的表达量差异不大；在小麦灌浆期,TαPHR1主要在叶片中表达,在茎杆中的表达量中等,穗和发育种子中的表达量较低。
我们对TαPHR1-A1调控缺磷响应的分子机制和有效利用途径进行了研究。利用拟南芥原生质体进行的BiCF(bimolecular fluorescence complementation)双分子荧光互补试验显示TαPHR1-A1定位于细胞核中,并可形成同源二聚体。在酵母细胞体外转录激活试验结果表明,TαPHR1-A1须形成同源二聚体才能启动高亲和力磷酸根转运基因TαPHT1.2的启动子(proTαPHT1.2)::报告基因的表达。通过比较proTαPHT1.2::GUS拟南芥转基因株系与proTαPHT1.2::GUS+35S::TαPHR1-A1拟南芥双转基因株系中GUS的表达水平,发现TαPHR1可显著提高低磷和高磷条件下根系中proTαPH1.2::GUS的表达水平,进一步说明TαPHR1可调控TαPHT1.2的表达。
本论文进一步研究了TαPHR1和TαPHT1.2改良植物磷效率的效果。在拟南芥中表达35S::TαPHR1可增加拟南芥在低磷条件下的主根长、根毛长度,提高了地上部和根系中的Pi含量。在拟南芥中表达proTαPHT1.2::TαPHT1.2可增加拟南芥在低磷条件下地上部生物量、主根长、根毛长度和根系中的Pi含量。在拟南芥中同时表达这两个基因可进一步促进拟南芥在低磷条件下的地上部和根系生物量、主根长、根毛长度,以及地上部和根系中的Pi含量。本文还进一步研究了转基因系促进磷吸收转运的分子机理,发现超表达TαPHR1-A1增强了一系列PSI(Pi-starvation response genes)基因的表达,如AtPHT1.1,AtPHT1.2,AtPHT1.4,AtAT4,AtIPS1,AtMYB75,AtPHO1:H1,miR399d和miR399f并下调了AtPHO2的表达。这些研究结果表明,利用TαPHR1和TαPHT1.2可提高植物磷效率。