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牛结核病(Bovine tuberculosis, bTB)是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis, M. bovis)等感染引起的一种人兽共患慢性消耗性传染病,该病被世界动物卫生组织(OIE)列入需通报的动物疫病之一。M. bovis拥有广泛的宿主,而牛是最敏感的宿主之一,它不仅能在动物之间传播,还能从动物传染给人,牛结核病的流行直接影响了畜牧业的生产力及人类的生命健康。因此,简单、快速、准确的牛结核诊断方法对于该病的防控具有重要的意义。IFN-y试验是一种体外T细胞免疫检测试验。传统用于IFN-y试验的刺激原是结核菌素纯蛋白衍生物(PPD),由于PPD成分复杂,包含很多广泛分布的分枝杆菌抗原,使诊断易存在假阳性的结果。由于PPD在生产过程中存在定性定量的困难,难以保证批次间的稳定性,所以使用PPD作为刺激原的IFN-y试验其特异性及稳定性有待进一步提高。结核分枝杆菌、牛分枝杆菌等致病性分枝杆菌特异性抗原蛋白,如ESAT6、CFP10和TB7.7(也称Rv2654c)等成分明确、制备简单、且易于质控,将其用于IFN-y检测时可以提高检测的特异性及重复实验的稳定性。本研究通过大肠杆菌系统成功表达了rHis-CFP10-ESAT6-TB7.7(简称rHis-CE-TB7.7)融合蛋白,并对包括该融合蛋白在内的28种结核分枝杆菌重组抗原进行牛结核外周血IFN-y体外释放试验,系统的评价与筛选出候选刺激原,为下一步研究奠定基础。1、结核分枝杆菌CFP10-ESAT6-TB7.7的融合表达、纯化和鉴定PCR扩增lhp-esat6-linker和linker-Rv2654c目的片段,构建pET32a(+)-lhp-esat6-linker-Rv2654c原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)。经IPTG诱导,免疫亲和层析纯化,SDS-PAGE分析显示在约45kDa处出现目的条带,说明融合蛋白获得可溶性表达。Western blot显示rHis-CE-TB7.7融合蛋白能分别与ESAT6单抗、His单抗、CFP10单抗和TB7.7多抗血清发生特异性反应,表明其具有良好的免疫反应性。将纯化后的rHis-CE-TB7.7蛋白与DDA佐剂充分乳化后皮下免疫6周龄C57BL/6雌性小鼠,二免一周后扑杀小鼠,制备脾细胞悬液进行细胞因子的检测和淋巴细胞增殖试验,同时采集血清进行抗体滴度的测定。夹心ELISA结果显示,分别用rGST-CFPIO, rGST-ESAT6和rGST-TB7.7蛋白刺激小鼠脾细胞后,蛋白免疫组IFN-y和IL-4的产生水平均显著高于阴性对照组(p<0.0001),且诱导产生的IFN-y水平显著高于IL-4(p<0.001),说明该融合蛋白能诱导机体产生Thl型免疫应答；淋巴细胞增殖试验结果显示CFP10、ESAT6和TB7.7均能诱导rHis-CE-TB7.7免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖；血清学检测结果显示rHis-CE-TB7.7融合蛋白能刺激机体产生高水平的分别针对CFP10、ESAT6和TB7.7融合蛋白的特异性抗体,这些结果表明rHis-CE-TB7.7具有良好的免疫原性,且该融合蛋白的三部分元件分别具有良好的生物学活性。2、牛结核外周血IFN-y体外释放试验刺激原的筛选使用本实验室构建纯化的28种结核分枝杆菌融合蛋白进行牛结核外周血IFN-y体外释放试验的检测。1542份阴性和1037份阳性临床样品的检测结果显示,以CE、CE-TB7.7和MPT63为刺激原的IFN-y释放试验与基于PPDB的IFN-y释放试验结果之间表现出最高的正相关性(Pearson’s r>0.7),其次为MPT64、MPT51和MPT83(Pearson’s r>0.5),也表现出一定的刺激潜力；进一步对CE、CE-TB7.7和MPT63三种最具优势的刺激原同步进行相同样品的检测(n=72),结果显示以这三种融合蛋白为刺激原的IFN-y释放试验与传统的PPDB刺激的IFN-y释放试验结果之间依然具有良好稳定的相关性,Pearson’s r分别为0.9492、0.9284和0.8943。对同样具有刺激潜力的MPT51、MPT64和MPT83进行了19份相同样品的检测,结果显示,以MPT51和MPT64为刺激原的IFN-y释放试验与PPDB刺激结果之间具有中等相关性(Pearson’s r分别为0.4605和0.4519),而MPT83则显示出弱相关性(Pearson’s r=0.3205)。综上所述,28种候选抗原中,CE和CE-TB7.7作为牛结核外周血IFN-y体外释放试验的刺激原具有明显优势,其次为MPT63,而MPT51和MPT64也具有一定的作为刺激原的潜力。另外,为了分析不同形式的刺激原对刺激效果的影响,分别取CE和CE-TB7.7融合蛋白形式和CFP10+ESAT6、CE+TB7.7和CFP10+ESAT6+TB7.7蛋白混合的形式进行IFN-y释放试验(n=34),结果显示,融合蛋白和混合蛋白的刺激结果与PPDB刺激结果均表现出高相关性(Pearson’s r>0.9),而且,混合蛋白与试剂盒检测结果的阳性符合率和阴性符合率均高于融合蛋白,显示混合形式的刺激原的敏感性和特异性可能优于相同蛋白的融合刺激形式。