目的第一部分:当前NK细胞毒性的研究一直专注于激活性受体和抑制性受体的平衡、信号转导、钙离子内流、免疫突触的形成和细胞脱颗粒等机制。然而,在NK细胞被激活或识别靶细胞的过程中,其细胞核内染色质的结构和状态是否发生改变我们仍然不清楚。在这一部分中,我们通过综合分析一套表达谱芯片数据和两套ChIP-seq数据,研究NK细胞在被激活的过程中其组蛋白甲基化修饰状态的变化。用一系列特异于催化H3K4和H3K27修饰酶的小分子抑制剂处理NK细胞以改变NK细胞甲基化修饰状态,研究NK细胞的脱颗粒水平,以及IFN-γ和TNF-α的表达。以期进一步分析组蛋白甲基化修饰状态对NK细胞激活的影响。第二部分:尽管NK细胞激活的机制研究还不够清晰,但很多研究显示正常的钙离子信号是NK细胞完成脱颗粒过程的必要因素。当钙离子信号被破坏后,NK细胞毒性颗粒外泌能力受阻,杀伤能力降低。然而,钙离子信号升高对NK细胞脱颗粒和杀伤的影响却鲜有研究。我们课题组研究发现小分子抑制剂UNC1999(特异于EZH2)可以上调NK细胞的钙流以及脱颗粒水平。因此,本课题的主要目的是研究UNC1999上调NK细胞钙流的机制,以及进一步研究钙离子信号与NK细胞脱颗粒和杀伤能力之间的关系。第三部分:我们前期研究发现,在小鼠造血干细胞中敲除mEzh2(mouse Ezh2),可以观察到小鼠骨髓、肝和脾中成熟NK细胞的绝对数和百分比被显著上调。而且基因芯片结果发现,mEzh2敲除的NKp细胞中,促进NK细胞后期成熟的转录因子Tox的表达被显著上调。因此,我们怀疑组蛋白甲基化酶mEzh2可以调控小鼠NK细胞的终端成熟。基于以上理由,我们用mEzh2fl/fl小鼠与Ncr1i Cre小鼠杂交,繁殖特异于NK细胞的mEzh2条件敲除小鼠,旨在研究mEzh2与NK细胞晚期发育和抗肿瘤能力之间的关系。方法第一部分:1.通过综合分析一套表达谱芯片数据和两套ChIP-seq数据,研究NK细胞在被激活的过程中,组蛋白甲基化修饰酶的表达变化和相关基因启动子区组蛋白甲基化修饰状态的变化。2.qPCR和Western blot研究NK细胞被激活前后,组蛋白甲基转移酶和去甲基化酶的表达水平。3.ChIP-qPCR研究NK活性相关基因的启动子区H3K4me3和H3K27me3的修饰在NK细胞被激活前后的变化。4.用一系列特异于催化H3K4和H3K27修饰酶的小分子抑制剂处理NK细胞以改变NK细胞甲基化修饰状态,用流式细胞术检测其脱颗粒水平和细胞中IFN-γ与TNF-α的表达水平。第二部分1.小分子抑制剂UNC1999和GSK343分别处理NK细胞,抑制EZH2的酶活性。用慢病毒法感染NK细胞,抑制NK细胞中EZH2的表达。2.流式细胞术检测NK细胞在处理前后的脱颗粒水平、杀伤能力和钙离子流。3.激光共聚焦显微镜观察NK细胞在处理前后与靶细胞结合、免疫突触形成和细胞毒颗粒极化的能力。4.利用高通量RNA测序技术筛选调控钙离子上调表型的因子。5.qPCR、Western blot和ChIP-qPCR研究UNC1999上调钙离子信号的分子机制。第三部分1.Western blot检测mEzh2条件敲除小鼠NK细胞中mEzh2的表达,以及H3K27me3修饰水平。2.流式细胞术检测NK细胞表面分化标志物以及功能蛋白IFN-γ的表达。3.小鼠尾静脉注射肺转移模型检测mEzh2条件敲除小鼠的抗肿瘤能力。结果第一部分:1.表达谱芯片中发现八个组蛋白甲基转移酶和组蛋白去甲基化酶的表达在NK细胞被激活后发生变化。2.qPCR和Western blot验证组蛋白甲基转移酶JARID2和组蛋白去甲基化酶UTY与KDM6B在NK细胞被激活后表达上调。3.ChIP-seq分析发现27个与NK功能相关的基因启动子区被H3K4me3和H3K27me3同时修饰,并且这些基因中的77.8%在NK细胞被激活后表达上调。4.ChIP-qPCR验证在NK细胞被激活后,PI3KCA、NFATC1和TNFSF9基因启动子区H3K4me3和H3K27me3的修饰发生显著变化。5.小分子抑制剂UNC1999可以上调NK细胞的脱颗粒水平,而OG-L002和MM102可以提高NK细胞中IFN-γ与TNF-α的表达。第二部分:1.小分子抑制剂UNC1999和GSK343抑制NK细胞中EZH2酶活性,或用sh RNA抑制NK细胞中EZH2表达,可以上调NK细胞的脱颗粒水平和钙离子信号,下调NK细胞短时间内的杀伤效率。2.抑制EZH2酶活性不影响NK细胞与靶细胞结合、免疫突触形成和毒性颗粒极化。3.抑制EZH2酶活性导致钙离子信号异常升高,进而导致异常毒性颗粒释放,最终导致很少的靶细胞可以获得毒性颗粒。4.抑制EZH2酶活性,导致钙离子通道PKD2启动子区H3K27me3修饰被抑制,并最终上调钙离子通道PKD2的表达。第三部分:1.mEzh2条件敲除小鼠的NKp46+CD3-NK细胞中mEzh2表达被显著下调;与此同时,H3K27me3的修饰水平也显著降低。2.mEzh2条件敲除小鼠的脾、骨髓和淋巴结中NKp46+CD3-NK细胞的百分比和绝对数同时上调;而且mEzh2条件敲除小鼠的NK细胞更加成熟。3.mEzh2条件敲除小鼠的NKp46+CD3-NK细胞被激活后,IFN-γ的表达水平显著高于野生型小鼠的NK细胞;而且小鼠尾静脉注射肺转移模型中观察到mEzh2条件敲除小鼠的抗肿瘤能力更强。结论第一部分:1.NK细胞在静息状态下,很多功能相关基因的启动子区被H3K4me3和H3K27me3同时修饰,处于“poised”状态。2.NK细胞在激活过程中,部分组蛋白甲基转移酶和组蛋白去甲基化酶表达发生变化,而与NK功能相关基因的启动子区甲基化修饰状态也发生变化,说明组蛋白甲基化修饰在NK细胞激活过程中起重要的作用。3.针对不同组蛋白甲基转移酶和去甲基化酶的小分子抑制剂UNC1999、OG-L002和MM102可能提高NK细胞毒性,为调控NK细胞毒性和免疫调节能力提供了新的思路。第二部分:1.抑制EZH2的表达或者酶活性可以上调NK细胞内质网中钙离子的储存,从而上调NK细胞内的钙离子信号,进而导致NK细胞在短时间内释放大量毒性颗粒到很少的靶细胞,下调NK细胞短时间内的杀伤效率。2.静息状态下的NK细胞中钙离子通道PKD2的启动子区被H3K4me3和H3K27me3同时修饰,抑制EZH2的表达或酶活性,可以改变PKD2启动子区的甲基化修饰状态,从而上调PKD2的表达水平。第三部分:1.在小鼠NK细胞的发育过程中,mEzh2不仅参与NK细胞的早期分化,而且调控NK细胞的终端成熟。2.mEzh2条件敲除小鼠的NK细胞在被激活后表达更高的IFN-γ,能更好的控制体内肿瘤的增殖和转移。