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本研究对5株分别分离自鹅(Go47)、白胸苦恶鸟(Wh44)、鸽(Pi14)、秧鸡(Ra18)和鸭(Du23)的NDV进行了毒力测定,并对其进行了全基因组序列的测定和分析,从而开展NDV的分子流行病学研究及探索NDV感染在不同宿主的分子机制,为更好地防治新城疫提供理论支持。
研究结果表明,Go47株MDT、ICPI、IVPI分别为58.4h、1.85和2.37,为强毒株;Wh44株的MDT、ICPI、IVPI分别为60.2h、1.28和0.71;Pi14株的MDT、ICPI、IVPI分别为64h、1.23和0.96,均为中等毒力株。Ra18株的MDT、ICPI、IVPI分别为102.5h、0.35和0.27,判定为低毒力株。Du23株的MDT>150h,ICPI为0.11,IVPI为0.13,判定为低毒力株。
对5株NDV的基因组分析结果表明,Go47株、Wh44株、Pi14株的基因组总长为15,192nt;Ra18株和Du23株的基因组总长为15,186nt,长度均符合“六的倍数”规则。5株病毒的基因组3末端(Leader)和5末端(Trailer)长度均相同,分别为55nt和114nt。5个毒株的基因组均含有6个ORF,编码NP、P、M、F、HN、L等6种蛋白,每个基因有相同的起始(UGCCCAUCC(u)U)和终止(AAU(1-2)CUUUUUU)序列。与经典的NDV毒株相比,Go47株、Wh44株和Pi14株均在NP基因和P基因之间的1647~1654nt处有额外的6碱基片段插入。其中Go47株的插入序列为“TCCCAC”,而Wh44株和Pi14株的插入序列则为“CCCCAA”。各毒株基因组的两端序列的前48个碱基互补现象严重,尤其是前8个碱基完全互补,而G047株则是前12个碱基完全互补。各毒株的P基因在484位均含有mRNA的编辑位点(UUUUUGG↓G)。
5个毒株的F基因全长均为1792bp,预计编码553个氨基酸组成的F蛋白。Go47株、Wh44株、Pi14株的F蛋白裂解位点的序列为RRQKRF,有多个碱性氨基酸的插入,符合NDV强毒株的分子特征,均与它们毒力测定的结果相符合。Ra18株、Du23株的F蛋白裂解位点的序列分别为GKQGRL和EKQGRL,均符合弱毒株的分子特征,且与其毒力测定的结果一致。5个毒株的F蛋白均有保守的5个潜在糖基化位点,除了Go47株外,其余四个毒株均在541位多出一个潜在糖基化位点。5个毒株均有3个与融合活性直接相关的抗原决定簇,其F蛋白均有12个高度保守的半胱氨酸残基。此外Wh44株和Pi14株在27位比Go47株多出一个半胱氨酸残基,而Ra18株和Du23株则在24位和514位多出两个半胱氨酸残基。 HN蛋白的长度有三种类型,其中Go47株、Wh44株、Pi14株的HN蛋白长度均为571个氨基酸,Ra18株的HN蛋白为601个氨基酸,Du23株的HN蛋白为577个氨基酸,5个毒株均有4个保守的潜在糖基化位点。此外,Go47株、Wh44株和Pi14株在508位多出一个潜在糖基化位点;Ra18株和Du23株在538位多出一个潜在糖基化位点;Ra18株还在600位多出一个潜在糖基化位点。除了13个完全保守的半胱氨酸残基位点外,Ra18株与其它4个毒株相比,在596位多出一个半胱氨酸残基。HN基因上具有11个保守的唾液酸受体结合位点,被认为是造成新城疫在不同种属间传播的分子机制根源。对参比的21株NDV HN蛋白的氨基酸序列进行比较后发现,所有毒株在上述位点均高度保守。
NP基因全长1746nt或1747nt,预计编码389个氨基酸的NP蛋白。P基因全长均为1450nt,预计编码395个氨基酸组成的P蛋白。M基因的cDNA全长均为1711nt,预计编码364个氨基酸组成的M蛋白。L基因的cDNA全长均为6703nt,预计编码2204个氨基酸组成的L蛋白。
对5个毒株各基因的生物信息学分析结果表明,各基因均有一定程度的保守性,其中NP和L基因的保守性最高。Go47株与国内鹅源分离株特别是99SF02株的亲缘关系最近,它们在进化上位于同一分支,同属于目前国内流行的基因Ⅶ型,但与国内早期的标准强毒株F48E9亲缘关系较远。Wh44株与Pi14株的亲缘关系较近,且均与国外报道的鸽源分离株处于进化的同一分支,同属造成ND第四次世界大流行的基因Ⅵ型。Ra18株与Du23株的各基因均有较高的相似性,它们均与Ulster67株的亲缘关系较近,在进化树上与其他弱毒株处于同一分支,同属基因Ⅱ型,但与国内广泛使用的疫苗株La Sota亲缘关系较远。