天蓝色链霉菌A3(2)稀有密码子UUA翻译忠实度相关基因的研究

来源 :华中农业大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:huangyulin2007
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天蓝色链霉菌A3(2)基因组测序菌株是M145。M145不同于其它衍生菌株,其染色体上的bldA基因不能够被中断,是营养生长的必需基因,相应基因型为bad<’->(bldA-dependent)。bldA编码天蓝色链霉菌基因组中唯一有效识别稀有UUA亮氨酸密码子的tRNA(Leu)UUA,在翻译水平上控制着含有TTA密码的基因的时空表达,在链霉菌的形态分化和生理分化调控系统中发挥着重要作用。本论文的目的是研究使M145中bldA变为必需基因的内在机制。 M145依赖bldA生长,表明M145中存在含有TTA密码的必需基因,本文首先尝试从其基因组中145个含TTA密码的ORF中找寻。选择SCD95A.45c构建其基因置换载体pilL352,利用该基因置换载体成功的中断了M145的SCD95A.45c基因,得到基因缺失突变株TW1。经验证,证明SCD95A.45c不是含TTA密码的必需基因,同时该基因也非bldA调控形态分化或次级代谢的靶基因。 根据阿维链霉菌的基因组信息,用Barn HI酶解染色体DNA构建基因组亚文库,筛选得到含有bldA同源基因tRNA57(本文命名为bldAa)的克隆pHL351,以此为基础构建基因置换载体pHL358。利用pHL358得到了bldA<,a>。基因缺失突变株TW10,最终鉴定阿维链霉菌NRRL8165的bad基因型为bad<+>。同时,实验证明在NRRL8165中bldA。调控菌株产孢分化和阿维菌素的合成。 为了阐明M145中bldA变为必需基因的机制,尝试用鸟枪克隆的方法从bad<+>菌株M600中随机克隆野生型的bad基因。鸟枪法共筛选了21,819个克隆,得到7个符合筛选标准的克隆子。PCR验证证明其染色体上的bldA已被中断。但对这部分克隆进行重转化验证时发现它们不能重复使M145::SCE25AT中的bldA被中断。说明原先的表型变化不是由外源克隆的转入造成的,可能是菌株的自身突变造成的。
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