第一部分肾络通对肾间质纤维化大鼠肾脏组织形态学的影响目的:本次实验采用单侧输尿管结扎(UUO)的方法建立梗阻性肾病肾间质纤维化的大鼠实验动物模型,以化瘀涤痰通络中药——肾络通对实验大鼠进治疗,并以醛固酮受体阻断剂——依普利酮作为对照药物干预治疗实验大鼠,观察实验大鼠的一般情况和肾组织病理形态学的改变,以探讨化瘀涤痰通络中药肾络通抑制肾间质纤维化的作用机制。方法:1动物分组和模型制备:实验动物自由进食和饮水,温度条件控制在(22±2)℃。适应性饲养1WK后,48只Wistar大鼠随机分为假手术组(Sham group)、UUO组(UUO group)、依普利酮组(EPL group)、肾络通组(SLT group),每组各12只。大鼠单侧输尿管梗阻模型制备参照Iwai T的方法。各组大鼠用10%水合氯醛注射后,于左侧中腹部切开皮肤,游离左侧输尿管,分别在输尿管上1/3和中1/3处用丝线结扎,切断输尿管,后逐层缝合皮肤。假手术组仅将输尿管游离但不结扎切断,轻轻拨动肠管后缝合腹部皮肤。术后第3天肾组织病理显示炎细胞浸润,第5日后胶原间质成分增多,第10日梗阻侧肾脏明显大于对侧肾脏,肾间质大量胶原增生及炎细胞浸润,肾小管上皮细胞变性、浊肿、脱落、坏死,肾小管部分萎缩、管腔闭塞或扩张,与文献报道相一致,符合肾间质纤维化的病理改变,模型复制成功。UUO术后大鼠死亡5只,用备用大鼠补足。2给药:术后即开始给药,依普利酮组给予依普利酮混匀于饲料中按100mg/(kg·d)剂量食入;肾络通组以肾络通煎剂26g/(kg·d)入水瓶饮用,假手术组及UUO组给予等容量生理盐水饮用,均每天1次。连续干预10天。10天后,各组大鼠称重后断头处死,切取梗阻侧肾脏,去除被膜后称重,部分肾组织置于4%多聚甲醛中固定,以备肾脏病理学检测。3指标检测及方法:每日观察并记录各组大鼠的精神状态、活动状况、皮毛变化、饮水量及进食量,分别测量每只大鼠体重、24h尿量;称量大鼠体重并摘取左侧肾脏称重,计算大鼠肾重/体重比值;左侧肾组织,分别行HE、Masson、天狼星红染色,光学显微镜下观察病理改变。4统计学处理:数据资料以均数±标准差(x±s)表示,使用SPSS 16.0for windows统计软件进行统计学处理,数据均在比较前进行正态性及方差齐性检验,满足正太性及方差齐性者,采用单因素方差分析(one-way ANOVA),组间比较采用LSD检验。结果:1各组大鼠的一般情况及梗阻侧肾重/体重比值的测定结果:一般情况:Sham组大鼠一般情况良好,较手术前没有明显变化。UUO术后各模型组大鼠一般情况不佳:毛发光泽度较差,对外界刺激反应不佳,饮食量明显减少。梗阻侧肾重/体重比较:UUO术后各模型组梗阻侧肾脏重量均较Sham组明显增加(P<0.01),而体重却明显降低(P<0.01),故而梗阻侧肾重/体重比值较Sham组明显升高。与UUO组大鼠比较,EPL组及SLT组大鼠梗阻侧肾脏重量均明显降低(P<0.01,或P<0.05),而体重明显升高(P<0.01,或P<0.05),故而梗阻侧肾重/体重比值均较UUO组明显降低(P<0.01,或P<0.05)。2各组大鼠梗阻侧肾脏病理形态学改变:HE染色时显示,Sham组肾脏组织结构无明显异常改变,肾小管上皮细胞结构无改变,排列整齐,肾间质无增宽、水肿等改变,仅可见少量炎细胞浸润;UUO组肾组织结构发生明显改变,肾小管上皮细胞结构异常,多见变性、坏死的病理改变,甚至部分脱落,肾间质可见大量炎细胞浸润,肾小管扩张明显;EPL组及SLT组肾小管上皮细胞变性、坏死及肾小管扩张程度较UUO组稍有减轻,炎细胞浸润的数量明显减少。Masson染色时显示,Sham组仅见少量胶原分布于左侧肾组织中的肾小管基底膜、小血管周围及肾间质部分;UUO组梗阻侧肾脏组织结构排列紊乱,肾间质明显增宽,部分肾小管萎缩,管腔扩张,肾间质中有大量胶原沉积,尤以髓质明显;EPL组及SLT组梗阻侧肾脏组织中胶原含量较Sham组明显增多,但较UUO组却明显减少。天狼猩红染色时显示,Sham组左侧肾脏的组织结构无明显变化,仅有少量胶原分布于肾间质部分;UUO组梗阻侧肾脏肾小管扩张明显,并有大量胶原成分在肾间质沉积;EPL组及SLT组肾间质胶原沉积增多,但较UUO组显著减少。第二部分肾络通对肾间质纤维化大鼠肾脏TGF-β1、CTGF的表达的影响目的:本次实验采用单侧输尿管结扎(UUO)的方法建立梗阻性肾病肾间质纤维化的大鼠实验动物模型,以化瘀涤痰通络中药——肾络通对实验大鼠进治疗,并以醛固酮受体阻断剂——依普利酮作为对照药物干预治疗实验大鼠,采用免疫组化、Western Blot、RT-PCR检测大鼠肾组织TGF-β1、CTGF表达,观察并分析依普利酮及肾络通对TGF-β1、CTGF的调控作用,以探讨化瘀通络中药肾络通抑制肾间质纤维化的作用机制。方法:动物分组、模型制备、给药方法同第一部分,共10天。实验结束时,留取肾脏标本,Real time-PCR、免疫组化、Western blot检测TGF-β1、CTGF及蛋白的表达。统计学方法同第一部分。结果:1 Real-time PCR检测TGF-β1、CTGF的表达:与Sham组比较,UUO组中TGF-β1m RNA、CTGFm RNA表达明显增强(P<0.01,P<0.05)。与UUO组比较,EPL组及SLT组TGF-β1m RNA、CTGFm RNA表达均明显下降,并且EPL组二者下降更为显著(P<0.05)。2免疫组化检测α-SMA、PCNA、TGF-β1、CTGF表达:假手术组α-SMA主要见于血管,呈强阳性,其他部位表达不明显;PCNA阳性细胞有少量表达,TGF-β1、CTGF主要表达于肾小管上皮细胞及肾小球,呈弱表达;UUO组中PCNA阳性细胞显著增多,主要以扩张的远端小管上皮细胞为主,α-SMA表达亦明显增强,主要见于肾小管间质及上皮细胞。TGF-β1、CTGF主要表达于肾小管上皮细胞及肾小球。与UUO组比较,依普利酮及肾络通组PCNA阳性细胞显著减少,α-SMA、TGF-β1、CTGF表达范围及强度均显著减弱。3 Western Blot检测TGF-β1、CTGF蛋白表达:UUO组TGF-β1、CTGF蛋白表达较Sham组明显上调。EPL组及SLT组TGF-β1、CTGF蛋白表达均较UUO组明显下降,并且EPL组下调更为显著,差异有统计学意义(P<0.01)。第三部分肾络通对肾间质纤维化大鼠肾脏Smads信号通路的影响目的:本次实验采用单侧输尿管结扎(UUO)的方法建立梗阻性肾病肾间质纤维化的大鼠实验动物模型,以化瘀涤痰通络中药——肾络通对实验大鼠进治疗,并以醛固酮受体阻断剂——依普利酮作为对照药物干预治疗实验大鼠,采用免疫组化、Western Blot、RT-PCR检测大鼠肾组织Smad3、Smad4、Smad7表达,观察并分析依普利酮及肾络通对Smad3、Smad4、Smad7的调控作用,以探讨化瘀通络中药肾络通抑制肾间质纤维化的作用机制。方法:动物分组、模型制备、给药方法同第一部分,共10天。实验结束时留取肾脏标本,Real-time PCR检测Smad4m RNA、Smad7m RNA的表达,免疫组化、Western blot检测Smad3、Smad4、Smad7表达。统计学方法同第一部分。结果:1 Real-time PCR检测Smad4m RNA、Smad7m RNA的表达:UUO组大鼠梗阻侧肾组织中Smad4m RNA的表达较Sham组明显增高(P<0.01);而Smad7m RNA的表达则显著下降(P<0.01)。EPL组及SLT组大鼠梗阻侧肾组织中Smad4m RNA的表达均较UUO组明显下降,尤以EPL组下降更为明显(P<0.05);EPL组及SLT组大鼠梗阻侧肾组织中Smad7m RNA的表达均较UUO组显著增高,尤以EPL组升高显著(P<0.05)2免疫组化检测Smad3、Smad4、Smad7表达:Sham组大鼠梗阻侧肾组织中Smad3、Smad4呈弱表达,Smad7表达增强,UUO组大鼠梗阻侧肾组织中Smad3、Smad4表达较Sham组显著上调,而Smad7表达则显著下降,主要表达于肾小管上皮细胞的胞浆中。与UUO组比较,EPL组及SLT组大鼠梗阻侧肾组织中Smad3、Smad4表达范围及强度均显著减弱;Smad7表达范围及强度均显著增强。3 Western Blot检测Smad3、Smad4、Smad7蛋白表达:UUO组大鼠梗阻侧肾组织中Smad3、Smad4蛋白表达较Sham组明显增多(P<0.01);而Smad7蛋白表达则较Sham组明显减少(P<0.01)。EPL组及SLT组大鼠梗阻侧肾组织中Smad3、Smad4蛋白的表达均较UUO组明显下降,尤以EPL组下降更为明显(P<0.01)。EPL组及SLT组大鼠梗阻侧肾组织中Smad7蛋白的表达均较UUO组明显升高,尤以EPL组升高更为显著(P<0.01)。结论:1采用单侧输尿管结扎的方法可成功复制梗阻性肾病肾间质纤维化大鼠动物模型,UUO大鼠肾脏病理显示大量炎细胞浸润及胶原成分大量沉积,符合肾间质纤维化的病理改变。化瘀涤痰通络中药肾络通可减少UUO大鼠肾组织中炎细胞的数量和胶原的沉积,减轻肾间质纤维化的损伤程度,从而延缓了肾间质纤维化的进程。2肾络通和依普利酮均可以通过抑制TGF-β1信号通路,下调CTGF表达,而抑制肾小管上皮细胞的表型转化并减少成纤维细胞的增殖,减少ECM的合成并增加其降解,从而减少ECM的积聚,减轻肾间质纤维化的程度而减缓其发展。3 TGF-β1/Smads信号通路是引起肾间质纤维化的共同作用途径,在UUO肾脏模型中,TGF-β1/Smads信号通路明显被激活,进而引起肾间质纤维化的形成。祛瘀化痰通络中药肾络通可通过抑制Smad3的表达水平,并阻碍其与Smad4的结合,同时上调Smad7的表达,而阻断了TGF-β1信号的传导,进而阻止了UUO大鼠肾间质纤维化的发生发展过程。