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目的: 研究NMDA受体亚单位NR1在生后早期正常大鼠的脑室下区神经干细胞上的超微分布特点,为进一步研究NR1在生后早期大鼠SVZ区神经发生中的作用提供形态学依据。
方法: 正常健康SD大鼠根据生后不同时期分为P7d、P14d、P21d、P28d四组,用含多聚甲醛、戊二醛和苦味酸的磷酸缓冲液(pH 7.4)冲灌固定,取脑,用同一固定液后固定,并做100μm振动切片,蔗糖浸泡,经液氮冻融处理后,室温下兔血清封闭,用nestin 标记神经干细胞,1.4nm金标记NR1,用包埋前免疫电镜技术,经系列脱水,置换,Epon812浸润,做平板包埋,聚合后在光镜下选取切片中免疫反应阳性部位,取材并粘贴于空白包埋块上,做70nm超薄切片(ReichertNissei,Leica),经醋酸铀、枸橼酸铅双重染色,在日立H-600透射电子显微镜下观察、拍照,并做图像分析。
结果:
1、免疫过氧化物酶标电镜方法显示,P7d、P14d、P21d、P28d正常大鼠SVZ区内均有nestin免疫反应阳性产物的黑色嗜锇电子致密物出现,呈絮状分布在SVZ区细胞的胞浆内。
2、免疫纳米金标电镜方法显示,P7d、P14d、P21d、P28d正常大鼠SVZ区内均有NR1免疫标记反应阳性物出现,呈黑色颗粒状,分布在SVZ区细胞的胞膜上、核膜上和胞浆内,且在胞浆内的线粒体上偶见免疫金颗粒的存在。
3、用免疫过氧化物酶标和免疫纳米金标结合的免疫电镜双标方法显示,P7d、P14d、P21d、P28d正常大鼠SVZ区内均有nestin免疫反应阳性产物和NR1免疫标记反应阳性物出现。Nestin免疫反应阳性物呈絮状分布在神经干细胞的胞浆内,NR1免疫反应阳性物呈黑色颗粒状弥散分布在神经干细胞和室管膜细胞的胞膜上、核膜上和胞浆内,并在神经干细胞的胞浆内可见有免疫过氧化物酶标记物与免疫金颗粒的共存。
结论:
通过nestin标记神经干细胞的免疫过氧化物酶标和1.4nm金标记NR1的免疫纳米金标结合的免疫双标电镜研究,发现NMDA受体亚单位NR1在正常生后早期大鼠SVZ区内神经干细胞和室管膜细胞的胞膜上、核膜上和胞浆内均有表达,且与nestin在神经干细胞的胞浆内共存。