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目的:肝癌危害生命主要原因在于转移。而肝癌转移是多基因参与的、复杂的过程,它涉及大量基因异常表达以及相关信号通路的异常。人即刻早期应答2基因(immediate early response 2,IER2)的表达产物可能是一种核蛋白,作为一种早期转录因子或转录调控因子发挥作用。目前虽有研究表明,IER2在胰腺癌及乳腺癌中表达可以促进肿瘤细胞迁移和侵袭。然而,IER2在肝癌细胞中的生物功能和潜在调控机制仍然是未知的。因此,本研究的目的是探讨IER2对肝癌细胞迁移、侵袭以及与细胞外基质(ECM)黏附和铺展影响,初步阐明IER2调控肝癌细胞迁移、侵袭及与ECM黏附作用的机制。方法:以肝癌细胞为实验对象,构建IER2过表达和RNA干扰表达的重组慢病毒,感染细胞后通过嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系,探讨IER2对肝癌细胞迁移、侵袭及与ECM黏附的影响。(1)分别采用RT-qPCR及Western blot实验方法检测IER2等在四种不同迁移潜能肝癌细胞中的表达。(2)采用CCK-8试剂盒检测IER2过表达及RNA干扰表达对肝癌细胞SMMC-7721和MHCC97H细胞活力的影响。(3)通过Transwell细胞迁移和侵袭实验研究IER2过表达和RNA干扰表达对SMMC-7721和MHCC97H细胞迁移和侵袭的影响。(4)利用肝癌细胞与ECM(细胞外基质)黏附实验以及细胞铺展实验研究IER2过表达和RNA干扰表达对SMMC-7721和MHCC97H细胞在不同基质上黏附以及在Fibronectin上的铺展的影响。(5)利用RT-qPCR及Western blot实验研究IER2过表达和RNA干扰表达对SMMC-7721和MHCC97H细胞中ITGB1和ITGB5表达水平的影响;利用荧光素酶报告基因实验检测IER2是否通过转录调控ITGB1的表达;进一步采用染色质免疫共沉淀(ChIP)实验验证IER2是否可以直接与ITGB1的启动子结合调控其转录;利用RNAi敲低过表达IER2的细胞中的ITGB1,采用Transwell细胞迁移、侵袭以及细胞铺展实验进一步验证IER2是否通过ITGB1影响肝癌细胞的迁移、侵袭和铺展。(6)利用Western blot实验研究IER2过表达和RNA干扰表达对SMMC-7721和MHCC97H细胞中ITGB1介导的相关信号分子表达及其活性的影响。结果:在成功构建慢病毒介导的IER2稳定过表达和RNA稳定干扰表达的SMMC-7721和MHCC97H细胞系的基础上,我们通过如下实验,系统地对IER2在肝癌细胞迁移、侵袭及与ECM黏附等指标中的地位和作用进行了初步探索。主要结果如下:(1)RT-qPCR和Western blot实验检测IER2在四种不同迁移潜能肝癌细胞中的表达,结果显示,具有低迁移能力的HepG2和SMMC-7721细胞中IER2的表达相对较低,而具有高迁移能力的MHCC97H和HCCLM3细胞中IER2的表达相对较高。(2)CCK-8细胞活力实验结果表明,IER2过表达和RNA干扰表达对SMMC-7721和MHCC97H细胞的细胞活力无显著性影响。(3)Transwell细胞迁移和Transwell侵袭实验结果均显示,IER2过表达可以显著促进SMMC-7721和MHCC97H细胞的迁移和侵袭(p<0.05),而RNA干扰表达能明显抑制这两种细胞的迁移和侵袭过程(p<0.05)。(4)细胞与ECM黏附实验结果表明,IER2过表达可以显著促进SMMC-7721和MHCC97H细胞与Fibronectin的黏附,而RNA干扰表达能明显抑制这两种细胞与Fibronectin的黏附(p<0.05);无论是IER2过表达还是RNA干扰表达均不影响SMMC-7721 和 MHCC97H 细胞与 Collagen type Ⅰ以及 Matrigel 的黏附。(5)细胞铺展实验结果显示,IER2过表达显著促进SMMC-7721和MHCC97H细胞在Fibronectin上的铺展(p<0.05),而IER2干扰表达则可以明显抑制这两种细胞在Fibronectin基质上铺展(p<0.05)。(6)RT-qPCR和Western blot实验结果表明,IER2过表达和RNA干扰表达可以分别上调和下调SMMC-7721和MHCC97H细胞中ITGB1的mRNA水平及其蛋白水平,但对ITGB5的表达无显著影响;荧光素酶报告基因实验检测结果显示,与空白对照组和对照空载病毒组相比,IER2过表达可以显著提高ITGB1启动子的活性(p<0.05),而IER2敲低表达可以明显降低ITGB1启动子的活性(p<0.05);ChIP实验结果显示,IER2可以直接与ITGB启动子上相应序列结合进行转录调控;RNAi敲低过表达IER2的SMMC-7721和MHCC97H细胞中的ITGB1后,可以显著抑制IER2诱导的肝癌细胞的迁移、侵袭和铺展。(7)Western blot实验结果显示,与空白对照组及对照空载病毒组相比,IER2过表达可以显著上调SMMC-7721和MHCC97H细胞中p-Y397FAK、p-Y407FAK、p-Y576/Y577FAK、p-Y861FAK、p-Y925FAK、p-S910FAK、p-Y419Src 和 p-Y118 paxillin(p<0.05),下调 p-Y527Src(p<0.05);而 RNA 干扰 IER2 表达则可以下调这两种细胞中的p-Y527Src,上调细胞中p-Y419Src;无论是IER2过表达还是RNA干扰表达对细胞中的FAK、Src和paxillin的表达均无显著影响。结论:(1)IER2的表达与肝癌细胞的迁移能力相关。(2)IER2表达可以促进肝癌细胞的迁移、侵袭以及在Fibronectin基质上的黏附和铺展过程。(3)IER2通过对ITGB1的转录调控,促进ITGB1的表达,激活ITGB1-FAK-Src-paxillin信号通路来影响肝癌细胞与Fibronectin基质黏附、铺展、迁移及侵袭。