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[目的]结核病防治面临的主要问题是缺乏针对耐（多）药结核的有效药物。目前从化学合成物中寻找新型抗结核药物无实质性突破，且多集中在针对结核菌本身而研发。结核菌为胞内寄生菌，为此提出本课题的研究目的，从宿主的角度出发，在我国丰富的中草药资源中发现针对宿主巨噬细胞自噬有调控作用的中药单体并研究中药单体诱导自噬对胞内结核菌存活的影响。此类药物的发现，可与针对结核菌本身的药物联用，对缩短结核病疗程，降低耐药结核的发生机率，减少结核病的复发和患者的再感染机率将起到极为重要的意义。 [方法]①四种中药单体黄芩苷、大蓟苷、杨梅素和淫羊藿苷对小鼠巨噬细胞系Raw264.7蛋白酶体的抑制活性检测:根据蛋白酶体能够水解荧光底物SuC—Leu—Leu—Val—AMC(S—LLVY—AMC)释放具有荧光的AMC(7—氨基—4—甲基香豆素)这一原理所建立的蛋白酶体体外筛选模型，检测四种中药单体对小鼠巨噬细胞系Raw264.7蛋白酶体的抑制活性（分子水平和细胞水平）。②四种中药单体对结核菌感染巨噬细胞白噬的影响:建立结核菌感染巨噬细胞模型，利用吖啶橙(AO)、溶酶体示踪剂Lyso—TrackerTM Red和Hoechst染色法观察四种具有蛋白酶体抑制活性的中药单体作用于细菌感染细胞模型后酸性囊泡变化;利用Western blot测定中药单体作用于细菌感染细胞模型后自噬相关蛋白LC3和p62表达水平的变化。③四种中药单体诱导结核菌感染巨噬细胞自噬机制的研究:利用Ⅲ型PI3K抑制剂3—MA单独及与四种中药单体联合处理结核菌感染细胞模型，经Western blot测定自噬相关蛋白LC3和p62表达水平的变化，判断四种具有蛋白酶体抑制活性的中药单体诱导结核菌感染巨噬细胞自噬是否经Ⅲ型PI3K途径发挥作用。④四种中药单体对结核菌感染巨噬细胞中结核菌存活的影响:利用CFU法进行各中药单体对细菌感染细胞模型中细菌存活的计数;利用real—timePCR测定药物作用模型后结核杆菌特异性基因Ag85B的mRNA表达量。 [结果]①四种具有蛋白酶体抑制活性的中药单体黄芩苷、大蓟苷、杨梅素和淫羊藿苷能够在细胞和分子水平抑制Raw264.7的蛋白酶体活性。②荧光显微镜显示四种中药单体作用于结核菌感染细胞模型24h后形成酸性囊泡较空白组明显增多（参照阳性对照雷帕霉素组）;Western blot结果显示黄芩苷、大蓟苷和淫羊藿苷浓度在150μM，杨梅素浓度在90μM作用细菌感染细胞模型24h后LC3Ⅱ表达增多，p62表达减少。③自噬Ⅲ型PI3K抑制剂3—MA与四种中药单体联合应用后，Western blot显示结果较空白对照组LC3Ⅱ表达增多，p62表达减少。④CFU结果显示四种中药单体作用于细菌感染细胞模型24h后，黄芩苷和淫羊藿苷150μM时结核杆菌的数量较空白组减少;黄芩苷、大蓟苷和淫羊藿苷150μM时real—time PCR检测Ag85B的表达水平较空白组降低。 [结论]四种中药单体黄芩苷、大蓟苷、杨梅素和淫羊藿苷在分子水平和细胞水平均能够抑制Raw264.7细胞蛋白酶体活性;四种中药单体黄芩苷、大蓟苷、杨梅素和淫羊藿苷能够诱导结核菌感染巨噬细胞自噬的发生;四种中药单体黄芩苷、大蓟苷、杨梅素和淫羊藿苷诱导结核菌感染巨噬细胞白噬的机制不是通过Ⅲ型PI3K途径实现的;四种中药单体中黄芩苷和淫羊藿苷能够抑制结核菌感染巨噬细胞中细菌的存活。