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单核细胞增生李斯特菌（Listeriamonocytogenes，LM）是一种重要的的人兽共患病原菌,该菌不仅可引起动物的急性传染病，而且免疫力低下的人群也易感染发病，被世界卫生组织（WorldHealthOrganization，WHO）列为四大食源性致病菌之一，对动物和人类的健康造成了极大的威胁。 LM是一种能寄生于宿主细胞内的兼性寄生菌，表达的抗原蛋白能通过MHC-I和MHC-II类分子呈递给CD8+和CD4+T细胞，诱导机体产生很强的免疫应答，所以越来越多的学者将LM进行毒力基因改造，用于研制做为抗病毒、抗肿瘤的疫苗活载体。然而，将其做为疫苗活载体必须安全可靠。现有的研究发现，LM的大多数毒力基因都受到prfA基因的调控，因此本研究运用基因工程手段对LMSL1强毒株第一致病岛(LIPI-I)中毒力因子调控蛋白（PrfA）的编码基因进行改造，利用同源重组技术构建能表达绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）的ΔprfA基因重组菌，为LM活疫苗载体和分子标记疫苗的研发奠定基础。研究方法和结果如下： 1.LM重组穿梭载体pKSV7-ΔprfA-gfp的构建：将gfp基因、prfA基因及其上、下游同源臂序列分别克隆到pMD19-T载体上，构建成重组质粒pMD19-T-prfA和pMD19-T-gfp，分别酶切后再连接形成pMD19-T-ΔprfA-gfp，酶切后的目的片段与穿梭质粒pKSV7相连，琼脂糖凝胶电泳和测序结果表明成功构建了同源重组穿梭载体pKSV7-ΔprfA-gfp。 2.LM电转条件的探索及优化：将带有抗性基因的穿梭质粒pKSV7加入到LM感受态细胞中，通过对不同生长状态LM的电击电压、电击次数、质粒浓度、电击缓冲液成分等重要参数进行摸索，优化LM的电转化条件。结果表明：使用氨苄青霉素（20mg/mL）等物质弱化细胞壁，电击电压为12.5kV/cm，电击次数为1次，质粒浓度约为0.8mg/mL，含0.5M蔗糖、10mmol/LHEPES、1mmol/LMg2+的电转介质，对数生长中后期的LM感受态细胞获得的转化子最多。该电转化条件快速、简便、高效。 3.基因重组菌LM-ΔprfA-gfp的构建：运用PCR和酶切的方法，将gfp插入prfA基因中，构建成克隆载体pMD19-T-ΔprfA-gfp，再经过酶切后将ΔprfA-gfp连接于pKSV7穿梭载体上，测序正确后电转化至LMSL1强毒分离株中，在温度（42℃）和氯霉素（10μg/mL）的双重压力下进行同源重组，利用gfp作为报告基因和PCR技术进行筛选，测序结果表明成功构建了LM-ΔprfA-gfp基因重组菌。 4.基因重组菌LM-ΔprfA-gfp的生物学特性初步研究：采用Real-timeRT-PCR对PrfA调控的溶血素（hly）基因mRNA的转录水平进行检测，比较LM重组菌与强毒株毒力基因hlymRNA转录水平的差异。同时以体外生长实验和小鼠攻毒实验检测重组菌的生长特性，毒力强弱和免疫保护力。结果显示重组菌hly的转录水平明显降低；强毒株对小鼠的LD50为105.53，而减毒突变株则为109.79，毒力下降了4.26个对数数量级。病理组织切片也表明突变株对小鼠肝、脾等脏器的致病性比LMSL1强毒株弱许多，对注射致死剂量LM的小鼠的免疫保护率达到90﹪。 本研究通过基因重组的方法获得了减毒突变株LM-△prfA-gfp，与LMSL1株有相似的生长特性，但小鼠毒力实验证明减毒重组菌的毒力明显下降。免疫保护试验结果显示，减毒突变株免疫组对同种血清型野毒株的攻击具有较好的免疫保护力，为进一步研发LM活疫苗载体奠定良好的基础。