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肿瘤的发生发展是由多因素诱导的，尤其与机体免疫系统异常密切相关。已有研究表明，肿瘤发生发展过程中，一方面患者免疫机能下降或缺失，导致免疫细胞识别肿瘤活性降低，难以控制肿瘤细胞的增殖和转移;另一方面则是肿瘤细胞发生特异性变异，利用免疫检查点抑制T细胞功能的发挥，逃逸机体免疫系统的识别。因此，单纯针对特定靶点的免疫学治疗很难达到有效抗肿瘤治疗效果。基于此，本研究构建一种兼具非特异性与特异性的肿瘤基因治疗给药系统LNT-PEI/siPDL1，即以具有非特异性免疫活性的阳离子化香菇多糖(Lentinan，LNT)为基因传递载体，负载靶向程序性死亡配体(Programmed death ligand-1，PD-L1)的小干扰RNA（Small interfiering RNA，siRNA）实现特异性阻断免疫检查点，对乳腺癌细胞进行免疫治疗，最终达到肿瘤治疗的目的，具体研究内容如下: 1、纳米载体LNT-PEI的构建。以高碘酸钾氧化法选择性地氧化LNT上的邻二醇，通过席夫碱反应将聚乙烯亚胺（Polyetherimide，PEI）接枝到胺基化多糖上制备得到基于香菇多糖的纳米载体LNT-PEI。利用红外图谱和Zeta电位验证载体的化学结构。体外考察LNT-PEI与核酸相互作用，结果显示LNT-PEI与siRNA质量比在6∶1以上时能够负载siRNA，形成紧密、稳定的复合物，这表明LNT-PEI构建成功，并且具有核酸负载能力。 2、LNT-PEI非特异性免疫活性研究。为了考察香菇多糖非特异性免疫活性是否受阳离子化改性的影响，以生理盐水和LNT为对照，将LNT-PEI经尾静脉注射至BALB/c小鼠体内，考察小鼠脾脏及胸腺等免疫器官指数变化、细胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α表达情况、以及巨噬细胞和脾细胞体外抗肿瘤活性等指标。实验结果显示，LNT-PEI组小鼠脾脏和胸腺指数高于生理盐水组，巨噬细胞和脾细胞的肿瘤细胞抑制率分别为18.12％和25.57％，三种细胞因子mRNA的表达均有所增加，且LNT-PEI组与LNT组作用结果相似。实验结果表明，阳离子化修饰的LNT-PEI保留了香菇多糖的非特异性免疫活性。 3、LNT-PEI/siPDL1特异性体外RNAi效应。首先，在细胞水平考察LNT-PEI作为基因传递载体的可行性。MTT检测结果显示LNT-PEI在5～640μg/mL浓度范围内对小鼠乳腺癌4T1细胞增殖没有明显抑制作用。流式细胞检测结果显示，经异硫氰酸荧光素标记的LNT-PEI作用于4T1细胞，培养2h之后摄取率便高达90％以上，作用6h摄取率最高;以LNT-PEI负载羟基荧光素标记的核酸（siRNA-FAM），细胞转染效率可达95.3％。随后，根据PD-L1mRNA序列设计四条siRNA，利用qPCR筛选得到RNAi效应最好的siRNA-Ⅱ作为靶向PD-L1的siRNA(siPDL1)。最后，利用LNT-PEI负载siPDL1构建得到纳米给药系统LNT-PEI/siPDL1，考察其特异性阻断免疫检查点，Western bloting实验结果表明LNT-PEI/siPDL1能够下调PD-L1的表达，抑制率为21.7％。划痕试验结果显示LNT-PEI/siPDL1能够显著抑制4T1细胞的迁移。 4、LNT-PEI/siPDL1体内抗肿瘤活性研究。以荷乳腺癌4T1细胞的BALB/c小鼠为模型，考察LNT-PEI的组织分布以及LNT-PEI/siPDL1的体内抗肿瘤活性。小鼠活体成像结果显示，纳米载体LNT-PEI经尾静脉给药4h后即可到达肿瘤组织并富集。尾静脉注射LNT-PEI/siPDL1，考察小鼠肿瘤体积变化、抑瘤率、肿瘤组织PD-L1表达情况及各项免疫指标。实验结果显示LNT-PEI/siPDL1肿瘤抑制率达43.9％，免疫组化分析肿瘤PD-L1的相对表达量为45.3％，抑制率达到54.7％，细胞因子分泌增加，免疫细胞抗肿瘤活性增强。体内实验进一步证明了LNT-PEI/siPDL1纳米给药系统显著下调肿瘤组织PD-L1的表达，提高机体识别肿瘤细胞能力，增强机体抗肿瘤免疫活性，通过香菇多糖非特异性免疫活性和siPDL1特异性阻断免疫检查点两者有机结合，实现联合抗肿瘤作用。