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目的:裂殖酵母Pol5蛋白对酵母生长至关重要。Pol5蛋白从人至酵母高度保守,人MYBBP1A(Myb结合蛋白1A)与Pol5蛋白同源,MYBBP1A是一种核仁蛋白,它参与核仁应激且与多种癌症发生与转移及蛋白的翻译调控有关。因此,对Pol5蛋白功能的研究对人类相关疾病的认识也有重要理论意义。有报道表明Pol5蛋白在调控细胞r DNA的转录过程中发挥重要作用,而且本实验组前期证实Pol5蛋白是赖氨酸乙酰化修饰蛋白Eso1蛋白潜在乙酰化底物,进一步蛋白质谱研究分析发现Pol5蛋白第742、743号氨基酸丝氨酸(S)位点被磷酸化修饰。然而Pol5蛋白磷酸化修饰对其蛋白功能及细胞生长的影响至今仍不清楚。本文通过构建HA标签标记的Pol5蛋白及其磷酸化修饰位点突变酵母株,并初步研究其表达情况。有望为进一步深入了解Pol5蛋白的功能提供新的研究模型。方法:在实验前期我们构建了含POL5基因的裂殖酵母表达质粒pdbletpol5HA和大肠杆菌克隆质粒p Clone Natpol5,且二者有相同的双酶切位点(Pst1、Xho1)。从pdbletpol5HA切下pol5HA基因,从p Clone Natpol5切下p Clone Nat基因,通过T4 DNA连接酶将两段基因连接而形成新的质粒p Clone Natpol5HA。该质粒有POL5基因序列,Nat筛选标记基因和抗氨苄青霉素标记基因,HA标记和终止密码子。单酶切后将该质粒同源重组进酵母基因组序列,通过测序确定我们得到正确的质粒,通过Western blot检测酵母正常表达Pol5蛋白。然后通过PCR引物引入去磷酸化和模拟磷酸化的基因突变位点,最后重新进行酵母基因组同源重组。观察酵母生长和Pol5蛋白表达情况。结果:1.POL5蛋白原位标记HA标签后可以正常表达。2.成功构建Pol5S742AS743A去磷酸化突变酵母株。3.成功构建Pol5S742DS743D模拟磷酸化突变酵母株。4.Pol5蛋白模拟磷酸化修饰及去磷酸化修饰后Pol5蛋白表达量不变。结论:本研究所构建的Pol5蛋白742、743号丝氨酸磷酸化修饰位点突变裂殖酵母株可以正常生长,为进一步对Pol5蛋白磷酸化修饰功能的研究提供的良好模型。Pol5蛋白磷酸化修饰位点突变裂殖酵母株的Pol5蛋白表达情况研究显示突变不会导致蛋白表达量的改变,为下一步磷酸化蛋白纯化分析提供了便利条件。Pol5蛋白磷酸化修饰的作用及对细胞的影响需要通过实验进行进一步分析。