论文部分内容阅读
Gongronellasp.JG是一株能够水解高分子壳聚糖产生低聚壳聚糖的真菌,也是第一株被报道产壳聚糖酶的Gongronella属微生物。本论文主要研究内容是优化Gongronellasp.JG在液体培养条件下产壳聚糖酶的条件、纯化发酵液中的壳聚糖酶同工酶并研究确定其基本酶学性质,此外,对内切壳聚糖酶csn2的基因进行克隆和分析。
论文的第一部分报道了Gongronellasp.JG在液体培养产壳聚糖酶条件的优化:JG菌的壳聚糖酶属于诱导酶,胶状壳聚糖是它的有效诱导物:经过单因子逐个优化,确定了JG菌产壳聚糖酶的培养基组成和培养条件为:在含1.5%葡萄糖、1%谷氨酸、0.2%磷酸二氢钾、0.02%硫酸镁、0.011%氯化钙、0.5%胶状壳聚糖,初始pH6.0的培养基中,30℃条件下180转/分钟振荡培养。在此条件下,发酵液中壳聚糖酶的最高产量可达800单位/升。
论文的第二部分报道了Gongronellasp.JG发酵液中壳聚糖酶同工酶的纯化:通过离心、超过滤、CM-SepharoseFastFlow弱阳离子交换层析、Superdex200凝胶过滤和SP-SepharoseFastFlow强阳离子交换柱层析等主要纯化步骤,我们从GongronellaJG发酵液中获得两个具有水解壳聚糖能力的蛋白质,分别是分子量为90kDa的csnl和分子量为28kDa的csn2。
论文的第三部分报道了csnl和csn2的基本酶学性质:csnl的最适反应pH在4.6-4.8之间;最适反应温度为50℃;50℃时的半衰期为65分钟;Mr12+是它的强效激活剂;它对85%脱乙酰度的胶状壳聚糖具有最高活性,但不能水解胶状几丁质和羧甲基纤维素;在浓度为20毫摩/升、pH4.8的醋酸钠缓冲液中、50℃条件下反应的Kg值为4.5毫克/毫升。Csn2的最适反应pH为5.6;最适反应温度在55-60℃之间;50℃和55℃时的半衰期分别为30和11分钟;Mri2+、Ca2+和Sr2+是它的强效激活剂;Cu2+在1毫摩/升时是激活剂,而在10毫摩/升时是抑制剂;它对胶状壳聚糖有最高活性,不能水解胶状几丁质和羧甲基纤维素;薄层层析结果显示它是一种内切壳聚糖酶,水解壳聚糖的终产物为以壳三糖为主的壳二糖、壳三糖和壳四糖的混合物;在浓度为20毫摩/升、pH5.6的醋酸钠缓冲液中、55℃条件下反应的Ka值为8.86毫克/毫升。
论文的第四部分报道了csn2的基因克隆和分析:分别克隆了其对应的基因组DNA编码序列和cDNA序列;成熟的csn2是一个由217个氨基酸构成的蛋白质,且这一壳聚糖酶属于糖苷水解酶GH-75家族;序列相似性分析的结果表明csn2与部分真菌来源的壳聚糖酶具有不同程度的相似度,但与Bacillus和Streptomyces来源的壳聚糖酶差别较大。