腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysms,AAA)是一种慢性炎症性疾病,其病理特征是主动脉壁的重塑,常常由于主动脉夹层动脉瘤破裂而导致病人死亡。AAA的形成是与多种因素有关,包括巨噬细胞的浸润,炎性因子和蛋白酶的释放,弹力纤维的断裂,血管平滑肌细胞的凋亡,胶原蛋白降解等,其中巨噬细胞浸润在AAA的发病机理中具有重要作用。研究已经报道,慢性炎症状态(包括动脉粥样硬化、氧化应激、血管紧张素II和炎性细胞因子)激活单核/巨噬细胞,被激活的巨噬细胞渗透到血管壁并释放蛋白酶,降解细胞外基质成分,包括胶原蛋白和弹性蛋白;同时,浸润进血管壁的巨噬细胞在血管中膜和外膜分泌炎性细胞因子,如:TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6,进一步加剧炎症反应。巨噬细胞浸润至血管壁的过程需要肌动蛋白细胞骨架的重新组构。在巨噬细胞浸润过程中产生一种膜突出结构:伪足小体(podosome)。目前已知,多种细胞结蛋白和信号蛋白以肌丝蛋白为核心包裹行成的束状podosome参与细胞的局部黏附和迁移。束状podosome呈现为点状的染色,寿命2-10 min左右,但在炎症环境下,束状podosome逐渐积聚变为环形podosome(称为podosome rosette),这种结构可持续数小时,持续进行细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)消化并促使细胞迁移。此外,podosome还包含多个信号蛋白,其中Rho A是podosome形成的一个关键信号分子。但是,目前关于podosome形成及其与巨噬细胞迁移的关系仍不清楚。Myo9b作为一种与肌丝蛋白相关的马达蛋白,其分子中包含的Rho GAP蛋白结构域具有抑制Rho信号的作用,因而能够调节巨噬细胞的极性和迁移。尽管Myo9b在破骨细胞中表达并调节podosome形成已有报道,但是Myo9b与动脉瘤发生发展之间的联系尚未阐明。人类Krüppel样因子5(KLF5)属于SP/KLF转录因子家族,其在羧基末端具有三个共同的C2H2型锌指结构。大量研究表明KLF5可以激活多种与心血管重塑相关的基因。已有报道,KLF5在大型未破裂的脑动脉瘤中高度表达,但是KLF5介导AAA形成的确切机制尚不清楚。在AAA形成过程中,KLF5与podosome形成和巨噬细胞浸润的关系仍然未知。因此,本研究利用Ca PO4诱导的小鼠腹主动脉瘤模型和人AAA组织,探讨Myo9b在KLF5介导的巨噬细胞podosome形成和巨噬细胞浸润中的作用,旨在为阐明KLF5在动脉瘤中的作用机制提供实验基础。第一部分KLF5通过促进巨噬细胞的迁移参与腹主动脉瘤的形成目的:探讨KLF5对巨噬细胞迁移的影响及其在AAA形成中的作用。方法:1通过实时定量PCR(q RT-PCR)和免疫组化检测人AAA组织中KLF5的表达,免疫双荧光共定位检测KLF5在血管组织中巨噬细胞和VSMCs的表达。2构建Ca PO4诱导的小鼠AAA模型,HE染色证实模型成功。q RT-PCR和免疫组化检测小鼠AAA组织中KLF5的表达。免疫双荧光共定位检测KLF5在小鼠AAA组织巨噬细胞和VSMCs中的表达。3杂交培育骨髓源单核细胞KLF5基因特异性敲除小鼠并建立AAA模型。4 HE和EVG染色检查血管组织和弹力纤维的变化。5免疫双荧光共定位KLF5和巨噬细胞。结果:1人AAA组织中KLF5表达升高与人正常主动脉组织相比,人AAA组织中KLF5m RNA表达水平升高,免疫组化KLF5染色阳性细胞数增加。对巨噬细胞和平滑肌细胞标志物进行免疫荧光染色的结果显示,在人AAA组织中巨噬细胞明显增多,并且平滑肌细胞和巨噬细胞中KLF5表达均明显增多,说明KLF5表达水平升高可能在AAA形成中发挥作用。2 Ca PO4诱导的小鼠AAA中KLF5表达水平增加在形态学检查证实,用Ca PO4诱导成功建立小鼠AAA模型的基础上,检查KLF5在实验型AAA组织中的表达变化。q RT-PCR结果显示,KLF5m RNA表达水平随着Ca PO4诱导天数的增加而升高,在第7天和第14天分别升高了2.39倍和2.14倍。免疫荧光染色结果证实,KLF5在巨噬细胞和VSMCs中均有表达,这与在人AAA组织中的检测结果相同。这些结果表明,KLF5参与人和小鼠AAA的形成。3巨噬细胞特异性敲除KLF5能减缓Ca PO4诱导的小鼠AAA形成KLF5-flox小鼠和Lys M-cre小鼠杂交培育遗传性敲除巨噬细胞中KLF5的小鼠(KLF5-/-),与野生型(WT)小鼠相比,KLF5-/-小鼠经Ca PO4诱导的腹主动脉膨胀率显著降低。HE染色结果显示,KLF5-/-小鼠的腹主动脉组织结构接近正常,弹力纤维断裂与WT组比较明显减少。结果显示KLF5-/-小鼠腹主动脉的弹力纤维断裂与WT组比较明显减少。免疫荧光染色结果显示,与WT组比较,在KLF5-/-小鼠的血管组织中,KLF5染色阳性巨噬细胞数量明显减少。这些结果表明,KLF5通过促进巨噬细胞浸润而参与AAA形成。小结:KLF5在人和Ca PO4诱导的小鼠AAA组织中表达升高。KLF5在血管平滑肌细胞和巨噬细胞中均进行表达。巨噬细胞特异性敲除KLF5能够减少巨噬细胞的浸润,抑制Ca PO4诱导的小鼠AAA的形成。第二部分KLF5通过上调Myo9b表达促进巨噬细胞podosome的形成和迁移目的:揭示KLF5促进巨噬细胞迁移和浸润的分子与细胞生物学机制。方法:1体外细胞划痕实验观察WT和KLF5-/-巨噬细胞的迁移。2Transwell小室实验观察WT和KLF5-/-巨噬细胞的侵袭能力。3扫描电镜观察巨噬细胞跨膜迁移时细胞足突。4活细胞工作站观察WT和KLF5-/-巨噬细胞的径向运动变化。5 m RNA表达谱芯片检测WT和KLF5-/-巨噬细胞的基因表达差异。6 q RT-PCR检测细胞运动相关基因的表达。7在巨噬细胞中过表达和敲低KLF5后检查运动相关基因的表达变化。8报告基因检测KLF5对Myo9b基因启动子的转录活性。9 Oligo pull-down分析确定KLF5在Myo9b基因启动子上的结合位点。结果:1 KLF5-/-巨噬细胞的迁移功能受损从KLF5-/-和WT小鼠分离培养骨髓源巨噬细胞,划痕实验结果表明,KLF5-/-巨噬细胞的迁移进入划痕区域的细胞数量比WT巨噬细胞显著减少。Transwell小室实验证实,与WT巨噬细胞相比,KLF5-/-巨噬细胞的侵袭能力受损。扫描电镜观察结果显示,与WT巨噬细胞相比,KLF5-/-巨噬细胞具有更少、更短的突触和伪足。细胞免疫双荧光染色结果显示,跨越滤膜的KLF5-/-巨噬细胞几乎不表达KLF5。进一步用动态细胞成像技术观察发现,与WT巨噬细胞相比,KLF5-/-巨噬细胞的径向迁移能力受损,迁移速率明显降低。2 KLF5通过直接与Myo9b启动子结合而上调Myo9b表达m RNA表达谱芯片检测结果显示,与WT组比较,KLF5-/-小鼠的运动相关基因在Ca PO4损伤的主动脉组织中表达显著下降。Gene Ontology富集分析发现,差异表达的基因主要集中于细胞Myosin肌丝和Myosin复合物等蛋白相关基因。q RT-PCR对芯片分析结果进行验证,Myo9a、Myo9b和Macf1基因表达在KLF5-/-小鼠显著下调。分别在Raw264.7中过表达或敲低KLF5,PCR和Western blotting结果均显示,在基础水平和TNF-α诱导情况下,在巨噬细胞中过表达或敲低KLF5均能够显著增加或降低Myo9a和Myo9b的m RNA和蛋白水平。报告基因和Oligo pull-down分析结果表明,KLF5通过直接与Myo9b启动子上的TCE位点结合而激活Myo9b基因表达。3 KLF5缺失导致Myo9b表达下调及podosome形成减少免疫荧光染色结果显示,Myo9b与podosome共定位。PDBu促进WT巨噬细胞形成podosome,但在PDBu处理的KLF5-/-巨噬细胞中podosome数量显著减少。Podosome阳性细胞数在TNF-α诱导的WT巨噬细胞中显著升高,但无论TNF-α诱导与否,KLF5-/-巨噬细胞中的podosome阳性细胞数均较少。Myo9b与Vinculin、Tks5或F-actin共定位的染色结果进一步证实,Myo9b定位于巨噬细胞的podosome中。Myo9a不与Cortactin和F-actin在podosome中共定位。在KLF5-/-巨噬细胞中过表达KLF5能够恢复podosome的形成。体内研究结果同样证实,podosome结构在人和小鼠AAA组织中与体外细胞中的结构相似。小结:KLF5在巨噬细胞中缺失造成细胞迁移功能受损。在巨噬细胞中,Myo9b是KLF5的直接靶基因,KLF5通过直接与Myo9b启动子上的TCE位点相互作用激活Myo9b基因转录,KLF5缺失通过导致Myo9b表达下调而减少podosome形成。第三部分Myo9b通过负性调节Rho A信号促进巨噬细胞podosome的形成、迁移和AAA进展目的:探索KLF5及受其调控的Myo9b调节巨噬细胞podosome形成的分子机制。方法:1用si-RNA敲低巨噬细胞中内源性Myo9b的表达,细胞免疫荧光染色观察podosome的形成是否发生变化。2 Transwell小室实验观察Myo9b敲低对巨噬细胞侵袭能力的影响。3在Myo9b的巨噬细胞中过表达KLF5后经免疫荧光染色观察podosome的形成。4用TNF-α刺激巨噬细胞后,GTPase pull-down和Western blot检测巨噬细胞中与GTP结合的Rho A、Cdc42和Rac1及其总蛋白水平。5在巨噬细胞中分别过表达或敲低KLF5,GTPase pull-down和Western blot检测Rho A、Cdc42和Rac1的激活和Myo9b表达变化。6用上述方法检查Rho A特异性抑制剂对巨噬细胞podosome形成和细胞迁移的影响。7免疫双荧光染色和q RT-PCR检测人AAA组织中Myo9b的表达和定位。结果:1 Myo9b敲低减少TNF-α诱导的巨噬细胞podosome的形成和迁移用Myo9b特异性si RNA(si-Myo9b)和非特异性si RNA(si-NS)转染巨噬细胞,细胞免疫荧光染色结果显示,与转染si-NS的细胞相比,在转染si-Myo9b的细胞中PDBu诱导的podosome形成显著减少,而且Myo9b敲低后,podosome的形成不再受TNF-α的影响。Transwell结果显示,Myo9b敲低后,穿越滤膜的巨噬细胞的数目显著低于转染si-NS的细胞。反之,在巨噬细胞中过表达KLF5能够促进podosome的形成,但是这种效应在转染si-Myo9b的巨噬细胞中被取消。2在巨噬细胞中KLF5敲低或缺失增加Rho A-GTP水平GTPase pull-down和Western blot结果显示,在TNF-α刺激的巨噬细胞中,与GTP结合的Cdc42、Rac1和Rho A水平显著增加,其中Rho A-GTP水平在30min达到峰值,6 h恢复至基础水平。与此同时,伴随着Rho A-GTP水平的下降,Myo9b的表达水平增加。在巨噬细胞中敲低或过表达KLF5后,经GTPase pull-down和Western blot检查Myo9b表达及Rho A-GTP水平的变化。结果表明,过表达KLF5显著上调Myo9b的表达,并且减少Rho A-GTP的水平;敲低KLF5显著下调Myo9b的表达,增加Rho A-GTP的水平。免疫荧光结果显示,与Rhosin处理的WT巨噬细胞相比,KLF5-/-巨噬细胞经Rhosin处理后,PDBu诱导形成的podosome数目显著增多。Transwell结果显示,与未经处理的KLF5-/-巨噬细胞相比,Rhosin处理后细胞侵袭能力显著增加。3在人组织中Myo9b表达上调并且定位于巨噬细胞免疫双荧光染色结果显示,人AAA组织中Myo9b的表达与正常组比较显著升高,且主要定位于MAC2阳性的巨噬细胞。q RT-PCR结果表明,Myo9bm RNA水平在人AAA组织中显著高于正常腹主动脉组织。相关性分析结果显示,KLF5m RNA水平与AAA的膨胀率的相关性并不明显(P>0.05),但是Myo9bm RNA水平与AAA的膨胀率具有显著正相关性(P<0.05)。小结:敲低Myo9b能显著减少TNF-α诱导的巨噬细胞podosome的形成和迁移。在巨噬细胞中,KLF5敲低或缺失增加Rho A-GTP的水平;KLF5通过上调Myo9b表达而抑制Rho A信号途径以及podosome的形成。巨噬细胞中Myo9b表达上调与人AAA的发生发展相关。结论:1 KLF5促使巨噬细胞迁移和动脉瘤形成。2在巨噬细胞中Myo9b是KLF5的直接靶基因。3 KLF5促进podosome形成和巨噬细胞迁移以及Myo9b的表达。4 Myo9b通过负性调节Rho A信号促进巨噬细胞podosome的形成、迁移和AAA进展。