阳离子胶原水凝胶涂层血管内覆膜支架实现兔主动脉局部基因转染的实验研究主动脉瘤(Aortic aneurysm)是一种危害性极大，死亡率甚高的全球性常见病。随着社会老龄化的到来，这类疾病的发病率呈逐年上升趋势。因此，如何改进治疗方法和技术、降低死亡率已成为国内外学者共同面临的一个亟待解决的、也是比较棘手的研究课题。1952年Dubost等首先对腹主动脉瘤进行了传统外科手术修补术，但死亡率很高，尤其是动脉瘤破裂的急诊手术死亡率达50％-60％。而且尚有大批患者因合并其他重要器官的功能障碍而难以实施手术治疗。1991年，Parodi等首次提出血管内主动脉覆膜支架置人术(Endoluminal AorticStent Graft P1acement)，即主动脉瘤腔内修复术(Endoluminal Aortic An—eurysm Repair，EAAR)。由于它与传统外科手术相比，具有不开胸、不开腹，创伤小，手术并发症少，住院时间短和适应证广泛等优点，目前已成为这类疾病，尤其是高危病人临床治疗的首选方法。尽管EAAR具有上述诸多优势，全身并发症发生率也较低，但靶血管局部的并发症却依然较高。其中最棘手的主要是术后的持续性内漏所导致的瘤体持续增大甚至破裂，以及中远期出现的内支架移位及人工血管覆膜材料破损等。国外学者通过对临床病例的再次开腹手术活检及尸检结果分析发现，尽管覆膜血管支架能够达到对病变主动脉局部的机械性修复目的，但由于靶血管局部不能及时地自我再生和修复，与覆膜血管支架之间几乎没有组织学上的愈合，从而造成了内支架与主动脉壁之间附着不牢固和内漏持续存在等问题。因此，如何促进主动脉壁自我增生和局部修复，使覆膜血管支架与主动脉壁尽快产生良好的愈合及修复，已成为亟待解决的关键问题和国内外研究的热点。 通过临床主动脉瘤壁标本的形态学及组织学分析发现，其特征性表现包括慢性炎性细胞浸润、细胞外基质降解和平滑肌细胞调亡等。细胞外基质是维持主动脉壁强度和弹性的重要因素，而平滑肌细胞又是一些基质分子，如弹力蛋白和胶原蛋白的主要来源，可以维持主动脉中层的完整性，促进主动脉壁与覆膜支架的愈合。因此，如果能通过基因转染与治疗的手段，实现主动脉局部目的治疗基因的稳定、高效的基因转染与持续基因表达，则有望从根本上解决病变主动脉局部的修复愈合问题。 目前血管系统基因治疗面临很多问题，包括基因转染率低，转染基因在靶血管内存留时间短，承载转染基因的生物可降解材料和涂层引起的局部炎性反应，全身系统基因转染和经皮输送过程的血管外膜转染等。因此提高靶器官及系统的基因转染率，实现转染基因的缓慢可控释放，选择生物相容性好的可降解材料，降低或杜绝全身系统基因转染，实现目的基因的靶向稳定地表达是血管内基因治疗研究的关键问题。本实验选用质粒(Plas-mid)作为载体，但这种载体存在转染率低的问题，因此，可应用生物可降解材料来承载质粒DNlA片段，并通过可降解材料的缓慢降解来实现所承载的目的基因的缓释以延长其在血管局部存留时问，从而提高基因转染率。 近年来，Tabata等开展了应用生物可降解的阳离子胶原水凝胶(Cationizedgelatin hydrogels，CGH)承载质粒DNA韵研究，取得了满意的结果，但该研究尚仅限于将CGH与质粒DNA复合物注射于动物的皮下及肌肉内。而本研究旨在将CGH均匀涂覆于表面改性后的血管覆膜支架的覆膜织物表面。 本研究拟以生物可降解材料CGH涂层的覆膜血管支架作为基本平台，以pCAGGS质粒为基因转染载体，来实现兔主动脉局部的报告基因LacZcDNA高效、靶向转染与表达，以便为未来进一步选择目的治疗基因实现主动脉局部基因转染并促进主动脉瘤愈合提供实验基础。 实验一 体外培养大鼠主动脉平滑肌细胞 pCAGGS-LacZ基因转染的实验研究 实验结果 1．pCAGGS—LacZ及pCAGGS浓度在4～5mg/ml之间，ABS值260/280均为1.6—1.8，说明DNA纯度良好； 2．双酶切反应后电泳结果证实提纯的质粒DNA基因序列与基因序列库中pCAGGS-LacZ的序列相吻合； 3．X—gal染色证实培养的RASMC细胞pCAGGS-LaeZ转染成功，并有β-半乳糖苷酶表达，细胞质内有深蓝染色，基因转染率约为30％； 4．Western-blotting蛋白免疫印记法检测到LacZ基因表达产物β-半乳糖苷酶。 实验二 阳离子胶原水凝胶涂层承载pCAGGS-LacZ 的血管内覆膜支架实验研究 实验结果 1．平均每个管状聚酯纤维织物(7mm×10mm)涂覆CGH的含量为O．0034g。 2．将该覆膜支架浸于Na<125>I标记的200μl pCAGGS—LacZ(4mg/m1)溶液中，平均每个支架的CGH涂层吸收pCAGGS—LacZ溶液比率为81．8％；支架缉装与释放后存留的pcAGGs—LacZ百分比高达94.2％；支架实际能够承载pCAGGS—LacZ的百分比为77.1％，即平均每个支架承载pCAGGS--LaeZ约617μg。 3．CGH涂层支架在兔体内降解释放模式：支架置人初期pCAGGS--LacZ爆发释放(约60％)；其后缓慢平稳降解，至第七天时降解释放完全。 实验三阳离子胶原水凝胶涂层承载pCAGGS—LacZ 血管内覆膜支架兔活体内主动脉壁基因转染的实验研究 实验结果 1．X线透视下置人覆膜支架后造影显示支架位置良好，主动脉内血流通畅，各主要血管分支显示清晰。 2．动物处死后尸检见支架位置良好，无移位及明显血栓形成。 3．X-gal染色：承载pCAGGS-LacZ覆膜支架处主动脉壁染色后可见散在深蓝色点状着色，证明具有β一半乳糖苷酶活性，承载pCAGGS的对照覆膜支架处主动脉壁未见深蓝色点状着色。 4．X-gal染色后的标本进行HE染色，见主动脉内皮细胞层损伤，只有少量内皮细胞残存，大部分内弹力板连续完整，个别处破损，中层平滑肌细胞排列整齐；无明显炎症细胞浸润及平滑肌细胞增殖，部分内皮细胞胞质内可见深蓝染色，另外个别内弹力板受损处可见平滑肌细胞胞质内深蓝染色。 5．Rt-PCR检测结果证实置人承载pCAGGS-LacZ覆膜支架处主动脉壁组织内含有编码β-半乳糖苷酶的mRNA。 6．覆膜支架置入处远端主动脉、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏Rt-PCR结果均为阴性，证实无全身系统播散性基因转染。 pCAGGS质粒是理想的非病毒性基因转染载体，LacZ可作为基因转染的报告基因，其表达产物的检测方便易行。CGH涂覆聚酯纤维的血管内覆膜支架是很有前途的基因转染承载平台，涂层材料与质粒DNA通过电荷吸引形成稳定复合物，在支架组装与输送过程稳定性好，通过CGH的降解达到目的基因的控释，并协助质粒DNA进人带负电的细胞膜，提高转染 效率。以CGH涂层的血管内覆膜支架作为承载平台可以实现兔主动脉壁局部的基因转染，无全身系统基因转染，对主动脉瘤的局部腔内修复性基因治疗的研究具有重要意义。