研究背景和目的：　　 由于体型小、便于操作,而且解剖生理特性与人特别相近的特点,小型猪已逐渐成为生物医药研究的重要模式动物,应用数量逐年大幅递增。本研究中的西藏小型猪是世界上体型较小的小型猪之一,来源于青藏高原、海拔2500-4300m的农区和半农牧区,是唯一能够适应高海拔气候和以放牧为主的猪种,封闭的地理环境使西藏小型猪保存了非常纯正的品种资源。本课题组于2004年将西藏小型猪从西藏引进至广州,目前已完成风土驯化及实验动物化研究,并开展了相关动物模型、药物实验及转基因克隆等研究。从免疫学、遗传学研究发现,该品系具有独特的免疫相关指标和遗传特征,加上其独特的外形,是一种优良的实验用小型猪品种。　　 基因工程动物的制备研究是目前生命科学领域关键技术之一,通过转基因或者基因敲除等操作改变动物基因的遗传组成,可将动物按照人们的意愿进行各种基因改造,获得满足各种需要的基因工程动物。目前,基因工程小鼠研究的最为成熟,常用的技术方法有原核显微注射法和ES细胞法。而猪的ES细胞虽然已有分离成功的报道,但其培养体系并不稳定,同时远没有达到推广应用的水平。另外猪的受精卵数量来源有限且受精卵内脂肪滴过多也不利于原核显微操作。因此利用这些传统的技术方法均难以获得转基因及基因敲除的基因修饰猪。　　 随着核移植克隆猪技术的出现并不断成熟,转基因克隆技术逐渐成为制备转基因及基因敲除猪的主要方法。该方法通过在体外培养的体细胞水平进行转基因及基因敲除操作,利用体细胞核移植技术达到对动物机体水平基因的修饰,获得基因修饰克隆猪。因此为了建立西藏小型猪的转基因及基因敲除研究体系,本研究拟通过转基因及基因敲除两个方面分别进行基因修饰克隆西藏小型猪的研究。　　 (一)多能性基因Oct-4绿色荧光报告系统转基因克隆猪的建立　　 转录因子Oct-4(POU5f1)属于POU(Pit-Oct-Unc)转录因子的家族成员,能够特异性识别DNA八聚体ATTTGCAT并与之结合,借此调控下游基因的表达。它特异性的表达于胚胎干细胞、原始生殖细胞等多能性细胞中,是一种重要的细胞多能性标记因子。　　 Oct-4为母性遗传的转录因子,在成熟的卵母细胞中即可检测到高水平的表达。基因组激活后,Oct-4基因随之也被激活表达。直到胚胎着床后,Oct-4基因表达逐渐停止,并仅限制在生殖细胞表达,而在已分化的体细胞中不表达。在体外培养的ES细胞中,Oct-4基因可以作为一个开关,直接调控ES细胞的全能性及自我复制能力的有无。　　 (二)敲除酪氨酸酶基因建立白化西藏小型猪的研究　　 本课题拟将细胞基因敲除技术与体细胞核移植技术相结合,制备酪氨酸酶基因敲除的白化西藏小型猪。白化西藏小型猪的建立,将为药物、化妆品的毒性及过敏反应提供标准化的动物模型。与传统的育种方法相比,转基因育种技术总体效率更高,不仅大大缩短了育种时间,且所获品系的遗传背景单一,是白化实验用西藏小型猪育种的更高效策略。　　 研究方法　　 (一)多能性基因Oct-4绿色荧光报告系统转基因克隆猪的建立　　 1、西藏小型猪Oct-4基因启动子区域的克隆与序列鉴定　　 根据genebank中大白猪Oct-4基因启动子区域的序列信息,设计引物oct-pro-F2/oct-pro-R2从西藏小型猪基因组内扩增Oct-4基因启动子区域的DNA序列。PCR产物连接pMD18-T载体,进行测序、比对分析。　　 为了进一步对西藏小型猪Oct-4基因启动子区域进行结构分析,本文将猪、人、牛、家兔、小鼠、大鼠的Oct-4基因5’调控区域进行多重比较分析。并根据已报道的功能结构区域,对西藏小型猪的功能结构域进行预测和分析。　　 2、pOGN2荧光表达载体的构建及体外瞬时转染检测应用分子克隆技术将上一步克隆并测序正确的西藏小型猪Oct-4基因启动子连接入pEGFP-N2载体的HindⅢ和KpnⅠ之间,AseⅠ和BgⅢ酶切去除CMV载体,载体末端平端化,平端化后自连。获得目的载体命名为pOGN2。载体pOGN2中猪Oct-4基因启动子替换载体中原有的CMV启动子,含有Oct4-EGFP和Ne0两个表达框,便于下一步荧光观察和药物筛选实验。　　 3、pOGN2转基因猪胚胎成纤维细胞的建立　　 在西藏小型猪怀孕30-35d时,无菌剖腹手术取出胎儿。利用胶原酶消化方法体外分离培养猪胚胎成纤维细胞。细胞药物筛选前,进行G418药物毒性试验。设置G418浓度分别为0μg/ml,200μg/ml,400μg/ml,600μg/ml,800μg/ml,1000μg/ml,1200μg/ml,1400μg/ml。根据细胞死亡情况确定G418筛选浓度。　　 4、p0GN2转基因核移植胚胎及p0GN2转基因猪的建立　　 猪卵母细胞的体外成熟培养:屠宰场取卵巢,置38℃左右的含青霉素和硫酸链霉素的生理盐水中,运回实验室。用配有14号针头的注射器抽吸3-8mm的卵泡。于成熟培养液中,38.5℃成熟培养42小时。卵母细胞成熟培养后,透明质酸酶消化去除卵丘,体视显微镜下挑选有第一极体的卵细胞,作为体细胞核移植的受体细胞。　　 5、利用pOGN2转基因猪胚胎成纤维细胞进行猪IPS诱导重编程研究　　 将人的pMXs-Oct4,pMXs-Sox2,pMXs-Klf4,pMXs-c-Myc同时转染HEK293T,包装逆转录病毒。将四因子病毒感染pOGN2转基因猪胚胎成纤维细胞,48小时后,消化离心细胞,重新铺细胞至100mm培养皿中,1×104/皿。更换:IPS诱导培养液。培养17-22天,镜下观察可出现IPS样的细胞克隆。荧光显微镜下观察IPS样细胞克隆是否表达绿色荧光,并挑取绿色荧光表达的细胞克隆,传代培养,进行IPS细胞的鉴定。　　 (二)敲除酪氨酸酶基因建立白化西藏小型猪研究　　 1、构建TYR基因基因打靶载体　　 (1)克隆TYR基因的未知基因组序列。通过比对人、牛、犬、鼠等已知的TYR序列,设计兼并引物,进行嵌套PCR克隆获得西藏小型猪TYR未知基因组序列。　　 (2)构建TYR基因正负筛选敲除载体,根据克隆所得的TYR基因组序列设计同源重组的左臂和右臂,利用分子克隆技术分别克隆入打靶载体pSSC-9载体中,获得TYR正负筛选基因敲除载体pSSC-tyrKO。　　 (3)TYR特异性锌指的设计、合成及体外筛选鉴定,TYR修复质粒的制备。参考小鼠TYR锌指的序列及锌指open库筛选结果,设计针对西藏小型猪TYR第一外显子的锌指一对。同时将该对锌指蛋白分别连接两组不同的核酸酶切酶(DD/RR,KK/EL)。设计引物进行overlap法合成锌指并测序。同时构建相应的修复质粒pSSC-tyrZFNKO。　　 2、打靶质粒转染猪胚胎成纤维细胞,阳性基因敲除猪胚胎成纤维细胞的筛选和鉴定。　　 (1)正负筛选基因打靶　　 将TYR正负筛选基因敲除载体pSSC-tyrKO进行酶切线性化,纯化后进行转染。采用lipo2000进行转染,转染48h后加入正筛选药物G418和负筛选药物GANC进行双筛。筛选12-15天后,挑取抗性克隆,进行传代培养。　　 (2)锌指介导基因打靶　　 待转染锌指及修复质粒的准备。无内毒素提取锌指质粒,修复质粒酶切线性化。将锌指及线性化的修复质粒共同转染猪胚胎成纤维细胞,转染后48小时加正筛选药物G418和负筛选药物GANC进行双筛。筛选12-15天后,挑取抗性克隆,进行传代培养。　　 3、以TYR基因敲除的细胞作为核供体,经体细胞克隆技术制备TYR基因敲除的西藏小型猪(TYR+/-)。　　 结论　　 (一)多能性基因Oct-4绿色荧光报告系统转基因克隆猪的建立　　 1、扩增获得西藏小型猪Oct-4基因5’上游启动子区域　　 2、成功构建含有Oet4-EGFP和NEO两个表达框的载体pOGN2,并通过猪IPS细胞转染验证载体构建成功。　　 3、获得整合载体pOGN2的西藏小型猪转基因胚胎成纤维细胞。　　 4、通过核移植重编程和IPS重编程研究结果表明,本研究已成功的建立了多能性基因Oct-4表达GFP报告系统。可广泛的应用于猪IPS诱导重编程体系的建立和完善。　　 (二)敲除酪氨酸酶基因建立白化西藏小型猪的研究　　 1、成功克隆TYR部分未知基因序列并构建TYR正负筛选基因打靶载体。转染细胞后,经正负筛选获得一个阳性基因敲除细胞克隆。　　 2、本实验设计并合成了西藏小型猪TYR基因的锌指一对,并在293T细胞验证该锌指有效。　　 3、设计构建了锌指鉴定的293T细胞模型,用于锌指合成后的鉴定筛选。　　 本研究的创新之处　　 1、本项目利用我国独特的小型猪品系。西藏小型猪,将体细胞基因修饰和克隆技术相结合,培育具有我国自主知识产权的基因修饰克隆西藏小型猪。　　 2、本研究首次将猪Oct-4基因5’上游完整的调控区域启动绿色荧光的表达,利用该报告系统,可直观、方便地根据绿色荧光的表达监测猪细胞内多能性基因Oct-4的表达情况。　　 3、根据酪氨酸酶基因结构和功能特点,采用基因敲除克隆猪技术制备白化西藏小型猪。为进行化妆品、药品的皮肤毒性实验及过敏反应等研究提供标准化的白化实验小型猪。此外,也为人类白化病发病机制和基因治疗研究提供大型实验动物模型。