目的:清华大学生物力学与医学工程研究所赵红平课题组针对蚕丝蛋白的抗肿瘤活性提取出桑蚕茧蚕丝蛋白肽(浓度300 mg/m L),本课题主要目的是围绕桑蚕茧蚕丝蛋白肽抗肺癌的活性及机制进行研究:1.首先对桑蚕茧蚕丝蛋白肽进行系统的安全性评价,评价其是否对机体具有较高的安全性。2.探索桑蚕茧蚕丝蛋白肽对人恶性肺癌细胞的体内体外增殖的抑制作用。3.初步探讨桑蚕茧蚕丝蛋白肽抑制人恶性肺癌细胞生长的作用机制。本实验结果将有助于拓展桑蚕茧蚕丝蛋白肽的抗肿瘤医学作用,为桑蚕茧蚕丝蛋白肽临床治疗肺癌提供了基础研究。方法:1.为评价桑蚕茧蚕丝蛋白肽的安全性,进行了系统的毒理学实验。将BALB/c小鼠,随机分成生理盐水组、桑蚕茧蚕丝蛋白肽低剂量组(15000 mg/kg)、桑蚕茧蚕丝蛋白肽高剂量组(30000 mg/kg),连续灌胃给药14天,给药期间测量小鼠的体重变化,观察并记录小鼠的生命体征。给药结束后取小鼠血液测量血常规及肝功能相关指标,并对小鼠进行系统的解剖,观察脏器变化。2.为检测桑蚕茧蚕丝蛋白肽体内外对人恶性肺癌细胞的增殖抑制作用,选取两种典型的肺癌细胞A549(肺腺癌细胞)和H460(大细胞肺癌)和一种正常肺上皮细胞Beas-2b,利用MTT比色法和克隆形成实验检测桑蚕茧蚕丝蛋白肽对肺癌细胞和正常肺上皮细胞的增殖抑制作用,并进行比较;皮下接种H460(大细胞肺癌)细胞建立裸鼠皮下移植瘤模型,将荷瘤鼠随机分为生理盐水组、顺铂阳性对照药组、桑蚕茧蚕丝蛋白肽低剂量组(200 mg/kg)、桑蚕茧蚕丝蛋白肽高剂量组(500 mg/kg),并通过腹腔注射和灌胃两种不同的给药途径分别给药,观察桑蚕茧蚕丝蛋白肽的体内药效,并比较两种不同给药途径的抗肿瘤效果。3.为了进一步研究桑蚕茧蚕丝蛋白肽抑制人恶性肺癌细胞增殖的作用机制,检测了其对人恶性肺癌细胞周期、凋亡及凋亡蛋白的影响。首先利用流式细胞仪技术检测了桑蚕茧蚕丝蛋白肽对人恶性肺癌细胞周期及凋亡的影响,然后通过Western blot技术检测其对凋亡通路关键蛋白Bax(促凋亡蛋白)和Bcl-2(抗凋亡蛋白)的调控作用。结果:1.系统的毒理学实验的结果表明,在给药期间小鼠的体重并未发生明显的降低,小鼠未出现异常的生命体征,检测血常规及肝功能指标均在合理的范围内波动,解剖后小鼠的脏器颜色及大小均正常,由此证明桑蚕茧蚕丝蛋白肽具有良好的体内安全性;2.MTT实验表明桑蚕茧蚕丝蛋白肽对恶性肺癌细胞的增殖具有较好的抑制作用,且对正常肺上皮细胞生长的影响较小,并且桑蚕茧蚕丝蛋白肽对其他类的肿瘤细胞也有一定的抑制作用,说明其抑瘤作用具有一定的广泛性;克隆形成实验证明桑蚕茧蚕丝蛋白肽可以影响肺癌细胞的克隆形成能力,并且具有较明显的量效关系;裸鼠皮下移植瘤实验证明桑蚕茧蚕丝蛋白肽在体内可以抑制裸鼠皮下移植瘤的生长,具有良好的抗肿瘤作用且毒副反应较低,并且腹腔及灌胃两种给药途径抑瘤率无显著差异;3.流式细胞仪检测结果表明桑蚕茧蚕丝蛋白肽可以使人恶性肺癌细胞周期发生阻滞,使其停滞在S期,还可以诱导人恶性肺癌细胞发生凋亡,且具有明显的量效关系;Western blot实验结果表明桑蚕茧蚕丝蛋白肽可以调控凋亡相关重要蛋白,可以上调促凋亡蛋白Bax,下调抗凋亡蛋白Bcl-2,从而诱导肺癌细胞发生凋亡。结论:桑蚕茧蚕丝蛋白肽对机体产生的毒副作用较小,安全性较高;它具有较好的体内、与体外的抗肺癌活性,并且还对其他类的肿瘤细胞增殖也有较明显的抑制作用,是一种作用较广泛的抗肿瘤天然提取物。基于细胞生物学及分子生物学方法,初步阐明了桑蚕茧蚕丝蛋白肽抗肺癌作用的分子机制,发现其可使人恶性肺癌细胞周期发生S期阻滞,并通过调控凋亡蛋白诱导肿瘤细胞发生凋亡。