磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)和磷脂酶Cγ-2(PLCγ2)是B淋巴细胞内两个重要的信号传导分子。P13K的催化产物PI-3，4，5-P<,3>可作为重要的第二信使传递信号。PLCγ2催化水解PIP<,2>产生IP<,3>和DAG，然后分别介导钙离子从内质网中释放和激活蛋白激酶C，最终导致NF-кB的活化。体外实验证明PI3K的催化产物PIP3募集PLCγ2及其蛋白激酶——BtK至细胞膜，进而引发其活化。因此在B细胞信号传导途径中，PI3K被认为是PLCγ2的上游信号分子。 已有研究表明基因敲除PLCγ2阻碍了B细胞受体介导的信号传导，同时也影响了由transitional 2(T2)细胞向成熟B细胞的分化，而PI3K的缺失也同样阻碍了B细胞的信号传导和成熟分化。进一步研究我们发现基因敲除PI3K不仅阻碍了T2向成熟B细胞地分化，同时也影响了边缘区(marginal zone)B细胞的发育。利用PI3K<-/->、PLCγ2<-/->和PI3<-/->PLCY2<-/->B细胞，我们研究了PI3K和PLCγ2在功能上的关系。PLCγ2的缺失不影响PI3K的激活，而PI3K的缺失仅仅部分阻碍了PLCγ2的活化。基因敲除PI3K和PLCγ2并不造成造血系统的缺陷，却导致早期胚胎的死亡。将胚胎肝细胞移植到B细胞缺陷的JAK3<-/->小鼠后发现，基因敲除PI3K和PLCγ2不仅导致外周B细胞的缺失，同时还影响了早期原B细胞(pro-B cell)向前B细胞(pre-B cell)的发育和分化。与此同时，我们还发现PI3K和PLCγ2的双重缺失几乎完全抑制了B细胞受体介导的信号传导。上述结果表明，尽管PI3K是PLCγ2的上游信号分子，但PLCγ2的活化并非完全依赖于PI3K，PI3K和PLCγ2的双重缺失更为严重的阻碍了B细胞的信号传导和成熟分化。因此PI3K和PLCγ2在B细胞受体介导的信号传导途径中行使独特的功能。 PLCγ2分子结构主要由一个PH结构域，两个磷脂酶活性结构域X，Y，两个SH2结构域和一个SH3结构域所组成，目前对于SH3结构域的功能知之甚少。为了研究SH3结构域的生物学功能以及PLCγ2在B细胞受体介导的信号传导中是否具有非磷脂酶的功能，我们通过点突变的方法构建了两个PLCγ2的变体：SH3结构域变体(SH3m)和磷脂酶活性缺失变体(LIM)。然后利用逆转录病毒介导的基因转移和骨髓细胞移植的方法研究这两个变体对B细胞信号转导的影响。结果表明，LIM阻碍了B细胞受体介导的信号传导和B细胞的成熟，这表明PLCγ2的磷脂酶活性对于B细胞的信号传导和成熟分化起关键性的作用。通过对SH3m的研究我们发现SH3m部分地影响了B细胞活化所引起的PLCγ2的膜募集，进而部分地抑制了B细胞受体介导的信号传导和B细胞的成熟分化。我们更进一步证明了PLCγ2的SH3结构域与B细胞内的接头蛋白-BLNK的相互作用，而SH3结构域的点突变破坏了这一作用。由此可知，PLCγ2的SH3结构域在B细胞受体介导的信号传导和B细胞的成熟分化中起着不可替代的作用。 近年来，许多研究表明半胱氨酸蛋白酶-8(caspase-8)不仅参与细胞凋亡，同时也参与细胞的增殖和分化，此外，它在小鼠胚胎发育中也起着重要的作用。为了进一步研究Caspase-8在生物体内的作用途径，我们以caspase-8为诱饵蛋白，利用酵母双杂交系统从小鼠T淋巴瘤和7.5天胚胎文库中筛选与之相作用的蛋白。经过四轮筛选，我们发现了一些与caspase-8相互作用的蛋白。免疫共沉淀(co-IP)分析证实了其中一个候选蛋白与caspase-8的相互作用。此蛋白与小鼠肿瘤敏感性基因(TSG101)具有高度的同源性。已有结果表明TSG101是泛素相关调节因子-1(SUMO-1)的负调控因子。由此我们推测TSG101可能通过与caspase-8的作用，从而抑制SUMO-1介导的蛋白降解，最终起到稳定caspase-8的作用。为了进一步确定caspase-8与相关蛋白作用的结构域，我们采用了GST-PULL DOWN技术。根据caspase-8空间结构，将分别包含caspase-8的DED、DED-1、DED-2、P20、P10结构域克隆至大肠杆菌表达载体pALEX，以GST融合蛋白的形式表达于BL21菌株中。同时过量表达大肠杆菌分子伴侣TF和GroEL/ES提高GST融合蛋白的可溶性。GST-PULL DOWN实验的建立为今后研究caspase-8与相关蛋白作用的空间结构域奠定了基础。