论文部分内容阅读
目的通过观察吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline quinone,PQQ）对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans,C.elegans）的寿命、生殖能力、运动能力、脂褐素和脂肪的积累、抗应激的影响以及清除ROS的能力,来探究PQQ抗衰老的效果;通过检测PQQ对衰老相关基因和自噬调控基因表达的影响及观察PQQ对不同基因缺陷型品系线虫抗衰老作用,探究PQQ延缓衰老的机制,为PQQ在抗衰老领域的研究提供理论依据。方法一、吡咯喹啉醌干预对秀丽隐杆线虫衰老的延缓作用将N2品系线虫分为对照组和0.25、0.5、1、2、4 m M PQQ干预组,对线虫进行寿命,生殖能力,运动能力测定,初步判断PQQ的延寿效果并筛选出最佳干预浓度和干预天数,随后用PQQ最佳干预浓度进行后续实验。线虫肠道荧光反映体内脂褐素积累,油红O染色观察线虫体内脂肪积累,测定胡桃醌导致的氧化应激环境和35℃热应激环境中线虫的寿命探究线虫的抗应激能力,运用H2DCFDA荧光探针测定线虫体内的ROS含量。二、PQQ通过IIS通路延缓线虫衰老将N2线虫分为对照组和1 m M PQQ干预组,荧光定量PCR法测定N2线虫中与衰老相关基因daf-2、daf-16、age-1、skn-1、sod-3、ctl-1、hsp16.2的相对表达量;测定daf-2、daf-16基因突变品系线虫对照组及其1 m M PQQ干预组的寿命、抗应激能力和体内ROS含量,检测方法同第一部分;用TJ356品系线虫测定daf-16的入核量;以CF1553线虫荧光测定sod-3表达量。三、吡咯喹啉醌通过调节自噬延缓线虫衰老将N2线虫分为对照组和1 m M PQQ干预组,q PCR法测定N2线虫中自噬相关基因bec-1和lgg-1的表达量;检测DA2123品系线虫的寿命并用Western blot法测定DA2123品系线虫体内LGG-1::GFP荧光蛋白表达量;对DA2123品系线虫中GFP::LGG-1阳性点进行计数代表自噬活性;运用RNAi技术干扰DA2123品系线虫daf-2、daf-16基因的表达并进行效果鉴定;对用RNAi技术沉默daf-2、daf-16的DA2123品系进行寿命和自噬水平的测定。结果一、吡咯喹啉醌干预对秀丽隐杆线虫衰老的延缓作用对于N2线虫,与其对照组相比,5个干预组线虫的生存曲线均右移,平均寿命均显著提高（p<0.05）,其中,1 m M PQQ干预组线虫的平均寿命最长;5个干预组线虫的产卵总量均无显著性变化（p>0.05）;线虫头部摆动能力检测结果显示,在干预的第2天,线虫各组之间的头部摆动频率无明显变化（p>0.05）;干预至第4天时,1 m M组线虫的头部摆动频率相比2 m M组和4 m M组,差异具有统计学意义（p<0.05）;而干预至第6、8、10天结果均显示,在5个干预组中,1 m M组头部摆动频率最高,与其他组两两比较也显示出差异均有统计学意义（p<0.05）。通过这3个实验得出,PQQ最佳干预浓度为1 m M,最佳干预天数为5天。后续实验中我们均选用1 m M作为PQQ的干预浓度,结果发现,1 m M PQQ干预组N2线虫的脂褐素含量、脂肪积累和ROS含量与其对照组相比显著降低（p<0.05）;抗氧化应激能力和抗热应激能力与其对照组相比均显著提高且差异具有统计学意义（p<0.05）。二、PQQ通过IIS通路延缓线虫衰老与对照组相比,1 m M PQQ干预组N2线虫中的daf-2、age-1 m RNA相对表达量显著提高,daf-16、sod-3、ctl-1和hsp-16.2 m RNA相对表达量显著下降,且差异均有统计学意义（p<0.05）。Daf-2、daf-16突变品系的寿命、抗应激能力和体内ROS水平在其对照组和1 m M PQQ干预组中均未发生显著变化（p>0.05）。对于TJ356品系线虫,其干预组线虫的daf-16入核量与其对照组线虫的daf-16入核量相比显著增多（p<0.05）;对于CF1553线虫,其1 m M PQQ干预组线虫sod-3荧光表达量比其对照组显著提高,差异均有统计学意义（p<0.05）。三、吡咯喹啉醌通过调节自噬延缓线虫衰老与对照组相比,1 m M PQQ干预组N2线虫中的自噬相关基因bec-1和lgg-1的m RNA相对表达量显著提高（p<0.05）。对于DA2123品系线虫,其1 m M PQQ干预组线虫的寿命、LGG-1::GFP荧光蛋白表达量、GFP::LGG-1阳性点数量与其对照组相比均显著增加（p<0.05）。运用RNAi技术干扰DA2123品系线虫中daf-2、daf-16基因的表达,发现两基因的表达量相对于未RNAi干扰组显著下降（p<0.05）;与对照组相比,daf-2和daf-16基因干扰后1 m M PQQ干预组线虫的寿命和自噬水平无明显差异（p>0.05）。结论PQQ能够延长线虫寿命且不损害其生殖能力。在1 m M最佳浓度的干预下,PQQ能够通过提高运动能力、降低脂褐素积累、降低脂肪积累、提高应激环境中的生存率并清除随衰老而积累的ROS延缓线虫的衰老。IIS通路调控的抗应激能力、ROS水平及自噬活性可能在PQQ延缓线虫衰老过程中发挥重要作用。