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研究背景及目的:动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是一种多因素共同参与的慢性疾病,是众多心血管疾病的病理基础。据《中国心血管病报告2018》报道,我国心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)患病率处于持续上升状态,截止2018年我国CVD患者已高达2.9亿,严重危害人们的健康。众多研究表明,炎症反应参与动脉粥样硬化发生发展的各个阶段,当血管受到炎症因素的刺激时,受损的血管内皮细胞和白细胞相互作用引发炎症级联反应,促进单核细胞与内皮细胞间的粘附作用,此为动脉粥样硬化病程起始的关键环节。白细胞介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)是由单核细胞、内皮细胞等多种细胞产生和释放的多功能细胞因子,可刺激集落刺激因子、血小板生长因子等细胞因子的产生,并可在细胞粘附、组织修复中起作用。有研究提出,脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)可使IL-1β表达上调,并促进单核细胞与内皮细胞粘附。但是,LPS调控IL-1β表达的具体机制尚不清楚,有待进一步研究。囊泡型ATP酶(Vacuolar ATP-ase,V-ATPase)是一种细胞膜质子泵,对维持细胞内外酸碱平衡起着重要作用,其V0亚基的d2亚型(ATP6v0d2)是该蛋白的重要组成部分。研究表明,ATP6v0d2主要分布于破骨细胞、肾脏细胞等组织细胞中,可通过调节破骨细胞微环境酸碱性影响破骨细胞的成熟过程。另有报道称,ATP6v0d2可通过与STX17和VAMP8的相互作用促进自噬溶酶体融合进而促进细胞自噬的完成,在维持巨噬细胞内细胞器的稳态,限制炎症和细菌感染等方面发挥着重要作用。然而,目前尚未有ATP6v0d2参与动脉粥样硬化发生发展的报道,ATP6v0d2是否可以通过介导LPS诱导的慢性炎症而参与动脉粥样硬化的病理过程,及其可能存在的具体机制仍需进一步研究。研究材料及方法:人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)和人髓系白血病单核细胞(Human myeloid leukemia mononuclear cells,THP-1)均购于美国标准菌库(ATCC)。1.分别用0、0.1、0.5、1μg/mL四个浓度的LPS刺激人脐静脉内皮细胞,24h后,用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)和免疫印迹技术(Western Blot,WB)检测 ATP6v0d2 和 IL-1β的表达。2.用1μg/mL的LPS刺激人脐静脉内皮细胞,并设置0、3、6、12、24h五个时间点,提取蛋白质和mRNA,检测ATP6v0d2和IL-1β的表达。3.ATP6v0d2小干扰片段处理人脐静脉内皮细胞24h后,加或不加LPS处理24h后,用qPCR和WB检测ATP6v0d2的转染效果,并检测IL-1β的mRNA和蛋白表达水平。4.ATP6v0d2小干扰片段处理人脐静脉内皮细胞24h后,加或不加LPS处理24h后,加入CFSE绿色荧光标记的THP-1单核细胞,37℃共培养5小时后用磷酸缓冲盐溶液洗涤,用倒置荧光显微镜观察粘附效果并拍照。用Image-J软件测量荧光点个数,即为粘附在内皮细胞上的THP-1单核细胞数。研究结果:1.用不同浓度梯度的LPS刺激人脐静脉内皮细胞,结果表明LPS可浓度依赖性下调ATP6v0d2的表达,且1μg/mL的LPS刺激时ATP6v0d2表达下调较明显。用1μg/mL的LPS在不同的时间点处理人脐静脉内皮细胞后,结果表明LPS可时间依赖性下调人脐静脉内皮细胞中ATP6v0d2的mRNA和蛋白表达水平。2.用不同浓度梯度的LPS刺激人脐静脉内皮细胞,人脐静脉内皮细胞中IL-1β的mRNA和蛋白表达水平上调,且具有LPS浓度依赖性。用1μg/mL的LPS在不同的时间点处理人脐静脉内皮细胞后,人脐静脉内皮细胞中IL-1β的mRNA和蛋白表达水平上调,且具有LPS时间依赖性。3.人脐静脉内皮细胞中干扰ATP6v0d2后,ATP6v0d2表达下降,而IL-1β的表达上升,且LPS诱导的IL-1β表达上调的作用增强。提示ATP6v0d2可能抑制LPS诱导的IL-1β表达上调。4.人脐静脉内皮细胞中干扰ATP6v0d2可使THP-1细胞与内皮细胞粘附增强。提示ATP6v0d2可抑制LPS诱导的THP-1细胞的粘附作用。结论:1.LPS可下调人脐静脉内皮细胞中ATP6v0d2的表达水平,同时上调IL-1β的表达水平,且都具有LPS浓度和时间依赖性;2.ATP6v0d2可抑制LPS诱导的人脐静脉内皮细胞IL-1β的表达;3.ATP6v0d2可抑制LPS诱导的THP-1单核细胞的粘附作用。