氧化型辅酶Ⅰ,即烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide,简称NAD+）是参与许多生理过程的必需辅酶。近年来,随着绿色生物技术的发展,NAD+在生物催化领域以及医药行业已经显示出其巨大的应用价值。尽管目前已经开发出构建NAD+高产菌株的生物技术,但是其低生产率仍然阻碍了其大规模的应用。本文利用分子生物学技术对大肠杆菌BL21（DE3）胞内NAD+含量进行了研究,通过削弱产物降解途径、强化合成途径关键酶、增加合成底物供给和调控能量代谢等多策略代谢工程构建高产NAD+菌株。在摇瓶水平上将胞内NAD+浓度从3.23μmol·g-1DCW提高到了41.6μmol·g-1DCW,主要研究结果如下:（1）多策略改造大肠杆菌以强化胞内NAD+的合成。首先,为削弱NAD（H）的降解,将与降解途径有关的基因nud E,nud C,ush A及maz G进行敲除。摇瓶发酵结果表明,在构建的单基因敲除菌株中,基因ush A的敲除使胞内具有较高的NAD+水平。而在其基础上构建的多基因敲除菌株可以使胞内NAD+浓度最高提高39%。第二,采用需整合基因直接替换需敲除基因的方式,将NAD+的Preiss-Handler合成途径中的关键酶基因nad E和pnc B在ush A位点进行串联过表达,摇瓶结果显示胞内NAD+浓度提高221%。第三,将PRPP合成模块和Preiss-Handler途径结合起来,在前述改造的基础上继续整合过表达磷酸戊糖途径中的基因gnd,zwf及prs以增强辅酶合成前体物质的供应。与出发菌株相比,胞内NAD+含量提高520%。第四,引入腺嘌呤补救代谢途径,敲除基因add、amn,敲入基因ado1以间接调控胞内ATP水平。ATP浓度的提高导致NAD+胞内浓度提高170%。最后,综合以上所有提及的代谢改造,利用多策略调控代谢工程构建高效生产NAD+的菌株,摇瓶发酵结果显示其胞内NAD+浓度较出发菌株提高734%。（2）研究诱导条件对重组菌株胞内NAD+合成的影响。分别从诱导温度、诱导剂浓度和诱导时机三个方面对高产NAD+的重组菌株进行优化。确定最佳的诱导条件为:诱导温度控制在17℃,OD600为0.6时添加0.8 mmol.L-1的IPTG。与培养条件优化前比较,胞内NAD+含量提高了26%。（3）整合过表达基因的转录水平与NAD+合成的相关性分析。利用SPSS软件分析有关过表达基因对胞内NAD+合成的影响。研究发现,基因nad E和pnc B的过表达对胞内NAD+的合成具有促进意义。（4）在构建的高产NAD+重组菌株中增加正向调控基因nad E和pnc B的拷贝数以解决大肠杆菌中NAD+生产的瓶颈。摇瓶结果显示,胞内NAD+浓度在优化水平上再次提高了22%。以上研究结果为进一步扩大辅酶类天然产物的生物合成和工业化应用奠定了基础。