论文部分内容阅读
阪崎克罗诺杆菌是一类条件致病菌,致死率很高。建立快速灵敏的检测阪崎克罗诺杆菌的检测方法,保护人们的生命安全意义重大。本论文基于单克隆抗体对阪崎克罗诺杆菌的酶联免疫检测方法(Enzyme Linked Immuno-sorbent Assay, ELIS A)进行了深入系统的研究,通过免疫小鼠取脾与骨髓瘤细胞进行细胞融合,经过细胞筛选、细胞克隆获得了两株效价高和特异性好的抗阪崎克罗诺杆菌的单克隆抗体细胞株3D11F和11C5B。通过对免疫分析方法工作条件的优化,建立了一种简便、快捷、实用的阪崎克罗诺杆菌双抗夹心ELISA方法。单克隆抗体包被量为0.5μg/well;封闭液为0.5%脱脂乳粉,封闭时间为1.5 h；样品稀释液为0.1% BSA-PBS;检测抗体稀释倍数为1：2000,检测抗体孵育时间为1h；酶标抗体孵育时间为30 min。该双抗夹心ELISA方法在纯培养物中的最低检测限是2×104cfu/mLψ与其他7株非克罗诺菌属的肠杆菌(大肠杆菌,奇异变形杆菌,弗氏枸橼檬酸杆菌,阴沟肠杆菌,福氏志贺氏菌,成团肠杆菌,肠炎沙门氏菌)无交叉反应,同时也针对克罗诺菌属属内做了交叉反应,与其他5种克罗诺杆菌(丙二酸盐阳性克罗诺杆菌,苏黎世克罗诺杆菌,克罗诺杆菌基因种,穆汀斯克罗诺杆菌,都柏林克罗诺杆菌)无交叉反应,此结果说明制备的抗体特异性好,对所有阪崎克罗诺杆菌有很好的结合力,对种外菌种没有交叉。整个检测过程可以在3h之内完成。按照0.1、1.0、10 cfu/100g的样品接种量接种至不含阪崎克罗诺杆菌的婴儿奶粉中,在改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素培养基(mLST-Vm)中培养经10h后1.0cfu/100g作为样品检出限。与阪崎克罗诺杆菌传统常规培养检测方法相比,该双抗夹心ELISA方法是简便快速、灵敏度高、特异性好的的检测方法。该方法可以用来快速的筛检婴儿奶粉中阪崎克罗诺杆菌的存在。