论文部分内容阅读
研究目的:研究BET家族蛋白抑制剂OTX015靶向MYC抗多发性骨髓瘤的作用及潜在机制。研究方法:(1)选用多发性骨髓瘤细胞株MM1S、RPMI8226作为实验对象。CCK8法测定OTX015对两株细胞增殖效率的影响并计算半抑制浓度(IC50)。采用计算出的IC50处理两株细胞,72小时后流式细胞仪进行细胞周期、细胞凋亡的检测。在OTX015作用后的4h、8h、24h应用Real-time PCR及Western Blot技术分别在基因及蛋白水平检测c-MYC的表达量变化。(2)Ficoll法分离骨髓瘤患者骨髓中的单个核细胞,培养得到骨髓原代间充质干细胞(MSCs),在成骨诱导培养基中诱导MSCs成骨分化,并于培养基中加入一定浓度的OTX015,两周后von kassa染色检测钙质沉积,RT-qPCR检测OSX、OCN、Runx2成骨指标的变化。(3)选用NPG小鼠进行体内实验,尾静脉注RPMI8226骨髓瘤细胞,在注射后第三周进行活体成像查看成瘤情况,选择显著成瘤的小鼠分为实验组和对照组,实验组小鼠每天给予口服OTX01575mg/kg,对照组小鼠予等体积药物溶剂,用药三周时,取实验组和对照组各三只小鼠行眼眶内眦静脉取血,收集血清后用荧光免疫吸附检测法(ELISA)测定并比较羧基末端肽胶原交联(CTX;表示骨吸收)和I型前胶原的N-末端前肽(P1NP;指示骨形成)的表达量差异。用药三周时分别取实验组和对照组各两只小鼠,处死后解剖取得股骨,microCT检测实验组和对照组股骨干骺端骨破坏的差异。(4)收集9例初治骨髓瘤患者骨髓,提取CD138~+细胞,CCK8法测定OTX015对细胞活性的影响,RT-qPCR检测c-MYC表达量变化。研究结果:(1)OTX015对骨髓瘤细胞株有明显的生长抑制作用,根据CCK8实验计算出的IC50分别为:MM1S 39.16nmol/L、RPMI8226 1600nmol/L。流式细胞仪检测细胞周期明显阻滞在G0/G1期,S期及G2/M期比例明显减少,未发现显著细胞凋亡。用药后c-MYC的表达随时间推移呈递减趋势。(2)骨髓间充质干细胞成骨诱导培养,von kassa染色可见用药组更多的钙质沉积,OSX、OCN、Runx2成骨指标的表达亦显著升高。(3)体内实验,加药组小鼠较对照组小鼠,PINP表达量显著上升,CTX-I表达显著下降,表明药物有抑制破骨、促进成骨的作用。MicroCT扫描显示加药组骨质破坏较对照组明显减轻,表明OTX015有对抗骨质破坏的作用。(4)OTX015可显著抑制骨髓瘤患者骨髓的CD138~+细胞活性,加药组c-MYC表达量较对照组明显下降。研究结论:OTX015可显著抑制骨髓瘤细胞生长;OTX015可显著减低骨髓瘤细胞c-MYC的表达。OTX015可通过促进钙质沉积促进骨形成,并抑制破骨从而对抗骨髓瘤骨病。OTX015可显著抑制CD138~+细胞活性,降低CD138~+细胞c-MYC的表达。