背景：肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension, PAH）是一种以持续的肺动脉压力和血管重塑为特征的进行性疾病。前期研究表明，由 SOCC所介导的钙离子内流所致的肺动脉平滑肌细胞（pulmonary arterial smooth muscle cells， PASMCs）内钙离子浓度失衡是缺氧性肺动脉高压发病的关键环节，而 SOCC是由经典瞬时受体电位通道（Transient Receptor Potential Canonical Channels, TRPC）所组成。TRPC属于瞬时受体电位（Transient Receptor Potential，TRP）超家族，目前已经发现的TRPC蛋白有TRPC1-TRPC7七种亚型，其中在大鼠远端肺动脉平滑肌细胞中表达的是 TRPC1、TRPC4和TRPC6，而在缺氧下仅TRPC1和TRPC6表达上调。缺氧诱导因子1（hypoxia induciblefactor1,HIF1）是一个对缺氧敏感的转录因子，由HIF1α和HIF1β两个亚基组成的异二聚体，其中HIF1β是组成性组成，而 HIF1α在常氧下可被泛素-蛋白酶体降解。在缺氧时，HIF1α稳定表达，迅速入核，与HIF1β结合成异二聚体，并与靶基因上游的缺氧反应元件（hypoxia response element, HRE）结合，从而激活靶基因的表达。骨形态发生蛋白（Bone morphogenetic protein4,BMP4）是BMPs亚家族的成员之一，最近研究发现BMP4在促进肺动脉平滑肌细胞增殖与迁移过程中发挥作用，且 BMP4下游信号的异常也与肺动脉高压的发生发展相关。BMP4作为配体，与BMP4的I型和II型丝氨酸/苏氨酸激酶受体结合，从而激活其下游的Smad-依赖型和Smad-非依赖型信号通路，调节靶基因的表达。我们的前期研究证明了HIF1和BMP4可以通过上调TRPC1和TRPC6的表达来上调细胞内SOCE以及细胞内基础钙离子浓度。　　目的：⑴原代培养大鼠远端肺动脉平滑肌细胞，明确HIF1是否可以调节 BMP4表达。⑵HIF1是否是通过结合 BMP4上游调控序列中的HRE元件调节BM4表达。⑶BMP4是通过其下游的哪种信号通路来调节rPASMCs中TRPC1、TRPC6以及基础钙的表达。⑷验证在人PASMCs中TRPC1,6对细胞内基础钙离子浓度，细胞增殖、迁移的影响，以及HIF1，BMP4对TRPC1,6表达的调节。　　方法：②雄性成年SD大鼠（250-350g）被用于分离大鼠远端肺动脉（PA，4级以下），分离的PA纵向剪开后刮去内皮细胞，用I型胶原酶消化。消化后的细胞接种于35mm培养皿，用含10％血清的低糖DMEM培养5-6天。PASMCs用免疫荧光检测α-actin，荧光显微镜下细胞计数，计算细胞纯度。②Trizol法提取PASMCs RNA,逆转录反应根据TAKARA公司RT试剂盒进行，荧光定量PCR反应也是根据TAKARA公司荧光定量PCR试剂盒说明书建立。反应产物的特异性通过溶解曲线为单峰来判断。③经不同处理的细胞中加入预冷的含 PMSF的RIPA试剂，然后用细胞刮把细胞刮下来。并离心收集蛋白液。蛋白浓度用BCA法测定，然后等量蛋白上样，10-12%SDS-PAGE胶分离，分离后的蛋白转到PVDF膜上，用含5%奶粉的TBST封闭，然后加入一抗4℃孵育过夜，TBST洗涤三次，加入二抗室温孵育1小时，洗掉二抗，加入ECL曝光。④siRNA序列均由上海吉玛公司合成，转染方法均按照 Invitrogen公司lipofectamine RNAiMAX试剂说明书进行。细胞转染前换上无血清无抗生素的培养基，转染后12h换上完全培养基。然后进行后续实验。⑤原代培养的PASMCs中加入7.5μM Fura2-AM，37℃培养箱孵育1小时，将玻片放入小室，然后将小室放入倒置显微镜下用PSS灌流，灌流后10分钟开始用荧光显微镜检测细胞内 Fura2荧光信号，然后用InCyte软件检测细胞信号，细胞内钙离子浓度由Fura2荧光比值计算获得。⑥向96孔板中加入2500个细胞/孔，24小时后向每孔细胞中加入100μl CCK8试剂，37℃生化培养箱继续孵育2小时，然后在450nm波长处测定细胞吸光度值。⑦向Transwell的下室中加入700μl无血清培养基，然后向Transwell上加入20000个细胞，在常氧和缺氧条件下继续培养24小时，然后用甲醇固定，并用结晶紫染色，染色后用棉签小心刮去上层细胞，用扫描显微镜拍照，并计数迁移细胞数。　　结果：⑴HIF1可以上调TRPC1、TRPC6、BMP4在大鼠远端肺动脉平滑肌细胞中的表达，并且BMP4抑制剂noggin可以抑制HIF1诱导的TRPC1、TRPC6的表达。⑵HIF1可通过与BMP4上游的HRE元件的结合来调节BMP4表达。⑶在慢性缺氧的rPASMCs中，BMP4可以激活经典的Smad通路及非Smad依赖的p38，ERK1/2旁路，只是缺氧条件下以p38, ERK1/2信号通路激活更为敏感。特异性沉默Smad，p38和ERK1/2信号通路均能抑制TRPC1，6的表达及细胞内基础钙离子浓度。⑷缺氧条件下人肺动脉平滑肌细胞中TRPC1、TRPC6、BMP4表达增高，沉默HIF1、BMP4可以抑制TRPC1、TRPC6的表达。抑制TRPC1、TRPC6的表达可以抑制肺动脉平滑肌细胞内钙离子浓度，细胞增殖及迁移。　　结论：①HIF1可通过与BMP45’-侧翼区的HRE元件的结合来调节BMP4表达。②BMP4可激活Smad，p38及ERK1/2信号通路来上调TRPC1/6的表达，但在缺氧条件下是以激活p38和ERK1/2信号通路为主。③TRPC1、TRPC6参与了调节缺氧条件下人肺动脉平滑肌细胞的基础钙离子浓度失衡以及细胞增殖与迁移，而HIF1、BMP4可以调节TRPC1,6的表达。