三棱散对人胃癌SGC-7901细胞增殖影响及其机制的实验研究

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目的:  1、三棱散活性成分的提取,完成三棱散提取物的制备。  2、观察三棱散提取物对人胃癌SGC-7901细胞生长抑制作用。  3、探讨三棱散提取物对人胃癌SGC-7901细胞增殖及凋亡作用的可能机制。  4、进一步研究三棱散提取物对胃癌SGC-7901细胞裸鼠移植瘤生长的影响。  方法:  1、在三棱散提取物制备的同时,应用高效液相法检测三棱散中主要活性成分,进行定量测定,并从方法学上客观评价提取液的质量。  2、培养人胃癌SGC-7901细胞,用MTT法观察不同时间(24h,72h)不同浓度三棱散提取物(0,1.25mg/ml,2.5mg/ml,5.0mg/ml,10.0mg/ml)对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响。  3、用不同浓度的三棱散提取物(0,1.25mg/ml,2.5mg/ml,5.0mg/ml,10.0mg/ml)处理SGC-7901细胞72h后,用流式细胞仪检测三棱散提取物对细胞周期阻滞及其凋亡的影响。  4、用RT-PCR法检测不同浓度三棱散提取物(0,2.5mg/ml,5.0mg/ml,10.0mg/ml)作用人胃癌SGC-7901细胞72h后细胞NF-κ Bp65mRNA、cyclinD1mRNA及p16mRNA表达情况。  5、用Western blot法检测不同浓度三棱散提取物(0,2.5mg/ml,5.0mg/ml,10.0mg/ml)作用人胃癌SGC-7901细胞72h后细胞NF-κ Bp65、cyclinD1及p16蛋白表达情况。  6、将人胃癌SGC-7901细胞移植于裸鼠,建立荷瘤鼠模型,分5-FU组、三棱散组、5-FU+三棱散组及对照组,按要求进行连续灌注治疗,观察各组裸鼠移植瘤的生长情况,进一步研究和证实三棱散提取物对人胃癌SGC-7901裸鼠移植瘤的影响。  结果:  1、三棱散提取物中含有阿魏酸、盐酸川芎嗪、洋川芎内酯Ⅰ、大黄酸等活性成分,其高效液相含量测定显示在线性、稳定性、重复性等方面均符合要求。  2、MTT结果显示,随着三棱散提取物浓度增高和作用时间的延长,人胃癌SGC-7901细胞增殖抑制率逐渐增高,与对照组比有显著性差异(p<0.05),同一浓度不同时间的细胞增殖抑制率相比,有显著性差异(p<0.05)。  3、用流式细胞术检测细胞周期阻滞情况显示,人胃癌SGC-7901细胞在G0/G1期表现出明显的增加(p<0.05或p<0.01),S期细胞明显的减少。细胞凋亡分析表明,与对照组比较,其他各浓度组均明显诱导细胞凋亡(p<0.05),其凋亡率随三棱散浓度增加而提高。  4、RT-PCR法检测人胃癌SGC7901细胞中NF-κ Bp65mRNA、cyclinD1mRNA及p16mRNA表达情况,随着三棱散提取物浓度的增加,NF-κ Bp65mRNA、cyclinD1mRNA表达逐渐减少,p16mRNA表达逐渐增加,呈现浓度依赖性,三棱散提取物浓度5.0mg/ml,10.0mg/ml时,NF-Bp65mRNA、cyclinD1mRNA及p16mRNA表达与Actin mRNA比值与对照组相比均存在显著性差异(p<0.05)。  5、Western blot法检测人胃癌SGC7901细胞中NF-κ Bp65、cyclinD1及p16蛋白表达情况,不同复方三棱散提取物浓度组NF-κ Bp65、cyclinD1及p16蛋白表达对照组相比均有显著性差异(p<0.05),NF-κ Bp65、cyclinD1蛋白呈现低表达,而p16蛋白呈现高表达。  6、5-FU组(G2)、三棱散组(G3)及5-FU+三棱散组(G4)对人胃癌SGC-7901裸鼠移植瘤的生长有明显抑制作用,其肿瘤抑制率分别为46.09%、46.57%,46.69%。三个治疗组对人胃癌SGC-7901细胞裸鼠移植瘤体积、重量的影响与对照组比较皆存在显著性差异(p<0.05)。  结论:  1、体外实验证明三棱散提取物对人胃癌SGC-7901细胞有较强的生长抑制作用,呈时间依赖性和浓度依赖性。  2、三棱散提取物以时间、剂量依赖方式影响人胃癌SGC-7901细胞的凋亡,且使人胃癌SGC-7901细胞G0/G1期数量增多,抑制人胃癌SGC-7901细胞的增殖。  3、RT-PCR法检测显示,NF-κ Bp65mRNA、cyclinD1mRNA呈现低表达,p16mRNA呈现高表达,这与Western blot法检测NF-κ B p65与CyclinD1蛋白表达的结果一致,由此可以推测,NF-κ B p65表达下调会直接影响CyclinD1蛋白表达,发挥细胞周期的正反馈调节,p16表达上调可启动细胞周期的负反馈调节,共同作用阻止胃癌细胞由G1/G0期向S期过渡,从而产生细胞增殖抑制及促进凋亡的作用。  4、三棱散提取物对胃癌SGC-7901细胞裸鼠移植瘤具有明显抑制作用,随着治疗时间的延长,其对肿瘤的抑制作用就更加明显,但研究发现5-FU组及三棱散+5-FU组对肿瘤的抑制作用与三棱散组并不存在明显差异,三棱散与5-FU的联合使用未能显示出一定的优势。
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